Em linha com a necessidade urgente de triagem para diabetes tipo 1, doença celíaca e doença por coronavírus 2019, desenvolvemos um ensaio de eletroquimioluminescência 6-Plex de alto rendimento para detectar simultaneamente todos os quatro autoanticorpos de ilhotas, autoanticorpos de transglutaminase tecidual e anticorpos para o domínio de ligação ao receptor do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave.
Um ensaio clínico em andamento, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), é o primeiro estudo de triagem na população em geral para diabetes tipo 1 (DM1) e doença celíaca nos Estados Unidos. Com a pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), a epidemiologia da COVID-19 na população em geral e o conhecimento sobre a associação entre a infecção por COVID-19 e o desenvolvimento de DM1 são urgentemente necessários. O método de triagem atualmente padrão do ensaio de radioligação (RBA) enfrentou dois grandes desafios: baixa eficiência com um único formato de ensaio e baixa especificidade da doença com uma grande proporção de anticorpos de baixa afinidade gerados na triagem. Com a plataforma do ensaio de eletroquimioluminescência multiplex (ECL) que estabelecemos anteriormente, foi desenvolvido um novo ensaio de ECL 6-Plex que combina, em um único poço, todos os quatro autoanticorpos de ilhotas (IAbs) para insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), antígeno de insulinoma 2 (IA-2) e transportador de zinco 8 (ZnT8) para DM1, autoanticorpos transglutaminase (TGA) para doença celíaca e anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) para anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) para DM1, autoanticorpos transglutaminase (TGA) para doença celíaca e síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) para COVID-19. O ensaio foi validado em cegos usando 880 amostras do estudo ASK, incluindo 325 amostras positivas e 555 todas as amostras negativas para anticorpos, e comparado com os RBAs padrão e um único ensaio ECL. Com as vantagens de alta eficiência, baixo custo e baixo volume sérico, este ensaio foi aceito como a principal ferramenta de triagem para o estudo ASK.
Grandes estudos epidemiológicos em todo o mundo demonstram que a incidência de diabetes tipo 1 (DM1) vem aumentando rapidamente em 3%-5% ao ano, e a prevalência de DM1 tem dobrado nos últimos 20 anos, especialmente em crianças pequenas 1,2. Os autoanticorpos das ilhotas (IAbs) geralmente aparecem anos antes dos sintomas clínicos e são atualmente os biomarcadores preditivos e diagnósticos mais confiáveis para DM13. A triagem para autoanticorpos DM1 pode identificar pessoas em risco de progredir para DM1 clínica, educar o público, reduzir em grande parte a complicação com risco de vida da cetoacidose e beneficiar ensaios clínicos para terapias de prevenção. Esforços mundiais de prevenção para DM1 estão em andamento e vários ensaios intervencionistas estão sendo realizados entre indivíduos com IAbs positivo para retardar a progressão para DM1 clínica, e o Barbara Davis Center for Diabetes lançou o primeiro ensaio clínico dos EUA de triagem na população em geral em 2016 para DM1 e doença celíaca, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . A doença celíaca (DC) é uma doença inflamatória intestinal crônica relacionada a fatores imunológicos e genéticos. A prevalência de DC em crianças com DM1 pode chegar a até 24,5%5. Mais da metade dos indivíduos com DC pode não apresentar sintomas típicos na apresentação6, portanto, o rastreamento sorológico para doença celíaca é bastante necessário.
Desde o início da pandemia da doença por coronavírus 2019 (COVID-19), mais de 200 milhões de casos foram relatados globalmente, e as crianças representam até 16% dos casos confirmados laboratorialmente7. Muitos estudos demonstraram o impacto do DM1 existente na gravidade e letalidade da infecção por COVID-198, enquanto o impacto da infecção por COVID-19 no desenvolvimento de DM1 não é claro. A investigação da taxa total de infecção por COVID-19 na população em geral pela determinação de anticorpos contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-COV-2) e o estudo da associação entre a infecção por COVID-19 e o desencadeamento da autoimunidade por DM1 ou a aceleração da progressão do DM1 são urgentemente necessários e muito importantes, enquanto o estudo ASK em andamento é uma excelente plataforma para isso. Devido ao formato de ensaio único e à geração de uma grande proporção de positividade de anticorpos de baixa afinidade, o ensaio padrão de radioligação (RBA) encontrou um gargalo de baixa eficiência e baixa especificidade da doença9. No presente artigo, apresentamos um novo ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) de 6 plexos construído em nossa plataforma de ensaio de ECL multiplex anterior usando uma placa multiple-Plex, combinando seis ensaios de autoanticorpos em um único poço, incluindo todos os quatro principais IAbs para insulina (IAA), ácido glutâmico descarboxilase-65 (GADA), antígeno de insulinoma-2 (IA-2A) e transporte de zinco-8 (ZnT8A), autoanticorpos para transglutaminase (TGA) para doença celíaca, e anticorpos do domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 (COVID-19A). Este é o primeiro ensaio multiplex que recrutou um painel completo de quatro grandes IAbs e combinou isso com TGA e COVID-19A. Foi validado e formalmente aceito como a principal ferramenta de triagem substituindo a RBA padrão no estudo ASK.
A intervenção para DM1 entrou na era pré-DM1, com programas de rastreamento em larga escala nacionais e internacionais em andamento para DM1 e ensaios clínicos em expansão sendo aplicados no estágio 1 do DM1 para revogar ou retardar a progressão para DM1 clínica12,13. Medições de quatro IAbs usando o RBA padrão atual com um único formato de ensaio IAb são trabalhosas e ineficientes para um programa de triagem em massa. Com a demanda urgente por um ensaio IAbs multiplexado de alto rendimento, o ensaio de ECL multiplexado, o ELISA ICA de 3 telas e a detecção de anticorpos por PCR de aglutinação (ADAP) emergiram como tecnologias atualmente competitivas. No estudo Fr1da de rastreamento para DM1 em uma população de crianças pequenas na Alemanha, o ELISA ICA de 3 telas combinando 3 IAbs (GADA, IA-2A e ZnT8A) foi usado como teste principal14. Uma grande limitação do ELISA ICA de 3 telas é a falta de AIA, que é principalmente o primeiro IAb a aparecer com alta prevalência em crianças pequenas com DM1. Além disso, o ensaio não é capaz de distinguir qual dos três IAbs é positivo de um sinal positivo, e cada amostra positiva precisa ser repetida com três ensaios únicos para confirmação. O ADAP15 combina GADA, IA-2A e IAA e ilustrou alta sensibilidade e especificidade do ensaio no workshop do IASP, mas carece de dados sobre o quão preditivo é na triagem de base populacional para estudos de DM1, que o workshop do IASP não é capaz de determinar. O ensaio de ECL multiplex no presente estudo é construído sobre a plataforma de um único ensaio de ECL que foi validado em relação ao RBA padrão atual em vários ensaios clínicos como TrailNet9,16, DAISY17,18,19 e o ASK 4,20,21 estudar. O presente ensaio foi validado contra o ensaio de RBA e ECL único usando 880 amostras de soro de participantes do estudo ASK. Como mostrado na Figura 2 e na Figura 3, os níveis de anticorpos entre 6-Plex e ECL única ou entre 6-Plex e RBA foram em sua maioria congruentes entre si para a positividade dos anticorpos. As taxas de coincidência de IAbs testadas por RBA e 6-Plex foram de 91,7%-97,8%, e as taxas de coincidência de IAbs testadas por ECL único e 6-Plex foram de 95,3%-99,2%. A discordância entre o ensaio de ECL e a RBA foi principalmente daqueles com IAb único. Os níveis de IAbs testados por 6-Plex e ECL único (r = 0,6431-0,9434, todos p < 0,0001) e 6-Plex e RBA (r = 0,5775-0,8576, todos p < 0,0001) também foram bem correlacionados. As TGA testadas pelo ensaio 6-Plex foram altamente correlacionadas com os resultados tanto da RBA (99,4%) quanto do ensaio de ECL único (99,4%). Além disso, o COVID-19A testado pela 6-Plex atingiu 99,8% de conformidade com os resultados do ensaio único de ECL.
Como resultado, o ensaio de ECL 6-Plex foi formalmente aceito como o principal método de triagem para o estudo ASK em andamento e substituiu o RBApadrão 22. Este ensaio demonstrou sua excelente sensibilidade e especificidade com maior rendimento, menor custo e menor volume de soro em comparação com a RBA padrão.
Foi documentado que, no estudo de triagem de DM1, IAb único detectado por RBA, que ocupou uma grande proporção de positividades de IAb, foram de baixa afinidade, com baixo risco de doença e resultaram em baixo valor preditivo geral 19,21,23,24,25,26. Essa predição de baixo risco causou enormes custos extras de visitas de acompanhamento e resultou em dificuldades para estudos preventivos de DM1. A plataforma de ensaio de ECL estabelecida foi demonstrada em vários ensaios clínicos para discriminar IAbs de alta afinidade de IAbs de baixa afinidade gerados por RBA e melhorar significativamente os valores preditivos para todos os quatro IAbs, especialmente com positividade única IAb16,17,18,21 . A tecnologia de ensaio de ECL multiplex foi construída sobre a plataforma do ensaio de ECL único, com essa vantagem distinta da detecção de abdominais de alta afinidade. No presente estudo, o ensaio de ECL 6-Plex ilustrou sua semelhança com os ensaios de ECL único correspondentes em sensibilidade e especificidade.
Algumas limitações e as preocupações técnicas do ensaio multiplex ECL utilizando múltiplas placas Plex já foram abordadas em publicações anteriores27,28. Com seis antígenos marcados em um poço, pode haver algumas influências entre diferentes antígenos, e o fundo do ensaio pode aumentar ao adicionar cada ensaio de anticorpos para multiplexação no mesmo poço. Uma grande quantidade de trabalho de otimização do ensaio é necessária para ajustar as condições do ensaio, especialmente para ajustar as concentrações finais de cada proteína do antígeno rotulada com base no ensaio quadriculado para cada antígeno, para manter a sensibilidade e a especificidade para cada ensaio de anticorpos. Como mencionado em estudos anteriores27,28, um pequeno número de amostras (<1%) resulta em falsa positividade na placa múltipla de Plex sem uma razão subjacente clara. Todos os resultados positivos devem ser repetidos e confirmados por um único ensaio de ECL como garantia de qualidade laboratorial de rotina; normalmente, os falsos positivos serão removidos. Resultados falso-negativos causados pelo "efeito prozona" observado no ensaio prévio de 7-Plex ECL27,28 não foram observados no presente estudo. No ensaio aqui descrito, retirou-se a etapa do tratamento ácido das amostras de soro do protocolo anterior; em vez disso, pré-aquecemos as amostras de soro a 56 °C por 30 min (etapa 5.1.). No segundo dia de lavagem da placa, usamos um tampão de lavagem contendo NaCl 0,4 M (etapa 8.1.) em vez de um tampão de lavagem regular para lavar a placa de forma mais rigorosa. Essas modificações tornaram o ensaio ECL multiplex mais simples e com fundo mais baixo, sem perder a sensibilidade do ensaio.
Em conclusão, este ensaio tem um excelente desempenho para detectar quatro IAbs, TGA e COVID-19A simultaneamente. O recurso de multiplexação, bem como o alto rendimento, o baixo custo e a pequena necessidade de volume sérico, tornam a triagem em larga escala para DM1 e doenças concomitantes muito mais viável na população em geral. Pacientes com DM1 ou qualquer doença autoimune têm um risco muito maior de outras doenças autoimunes. O ensaio de ECL multiplex fornece uma excelente plataforma para rastrear DM1 e múltiplas doenças autoimunes simultaneamente.
The authors have nothing to disclose.
O estudo foi apoiado pela concessão JDRF 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH grant DK32083 e Diabetes Research Center (DRC) grant P30 DK116073.
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |