Uno screening multiplexed ad alto rendimento per diabete di tipo 1, celiachia e COVID-19

Il protocollo di ricerca è stato approvato dal Colorado Multiple Institutional Review Board. 1. Preparazione del buffer Preparare il tampone di etichettatura (2x PBS, pH 7,9): aggiungere 100 ml di 10x PBS a 400 ml di acqua distillata e regolare il pH utilizzando NaOH a 7,9. Produrre 3 mM di biotina e Ru Sulfo-NHS: sciogliere 1 mg di biotina in 588 μL di tampone di etichettatura e sciogliere 150 nmol di Ru Sulfo-NHS in 50 μL di tampone di etichettatura. Preparare il tampone antigene (1% BSA): sciogliere 5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 500 ml di 1x PBS. Preparare il tampone di rivestimento (3% Blocker A): sciogliere 15 g di Blocker A in 500 mL di 1x PBS. Preparare il primo tampone di lavaggio (0,05 % Tween 20, PBST): mescolare 2,5 mL di Tween 20 in 5.000 mL di 1x PBS. Preparare il secondo tampone di lavaggio (0,4 M NaCl): mescolare 50 mL di 5 M NaCl in 575 mL di acqua distillata per ottenere la soluzione 0,4 M NaCl.NOTA: Per un’etichettatura efficiente, utilizzare sempre soluzioni di biotina e Ru Sulfo-NHS appena preparate e non quelle conservate realizzate in precedenza. 2. Etichettatura delle proteine dell’antigene con biotina e Ru Sulfo-NHS separatamente NOTA: Si raccomanda una maggiore concentrazione di proteina dell’antigene ≥0,5 mg/ml per una maggiore efficienza di etichettatura. Preparare sei soluzioni mirate di proteine antigenetiche, tra cui proinsulina, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG e dominio legante il recettore (RBD) della proteina spike di SARS-CoV-2. Calcolare le moli di ciascuna proteina dell’antigene in base al suo peso molecolare e fare rapporti molari appropriati di biotina o Ru Sulfo-NHS. Il rapporto tra antigene e somma di biotina o Ru Sulfo-NHS sarà 1:5 per piccoli antigeni molecolari (peso molecolare ≤10 kd), come la proteina proinsulina. Per gli antigeni molecolari medi (peso molecolare 10-50 kd), come ZnT8, il rapporto si adatterà a 1:10. Per antigeni di peso molecolare di grandi dimensioni (peso molecolare >50 kd), come il GAD, il rapporto molare sarà 1:20. Dividere la proteina dell’antigene in due parti uguali e mescolarla separatamente con biotina e Ru Sulfo-NHS utilizzando il rapporto molare calcolato nel passaggio 2.1. Incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 1,5 ore, evitando la luce.NOTA: Tutte le sostanze chimiche riducenti come il Tris o la glicina nel tampone della proteina dell’antigene devono essere rimosse da una colonna di spin dimensionale innescata con un tampone di 2x PBS (pH 7,9). Innescare le colonne di spin con 2x PBS (la dimensione della colonna di spin, 2 mL o 5 mL, dipende dal volume della proteina dell’antigene di marcatura): aggiungere 1 ml di tampone PBS 2x alla colonna di spin, centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e ripetere il passaggio 2 volte di più. Lasciare che la miscela proteina-biotina dell’antigene o -Ru Sulfo-NHS passi attraverso la colonna di spin innescata 1x (centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 minuti) fino alla purificazione e interrompere la reazione di etichettatura. Misurare il volume finale della proteina dell’antigene marcata eluita dalle colonne di spin, calcolando le concentrazioni di proteina antigene marcata con biotina o Ru Sulfo-NHS. Fare aliquote più piccole di proteina antigene marcata (50 μL/tubo) e conservarle a -80 °C per un uso a lungo termine.NOTA: La copertura delle proteine dopo ogni colonna di spin sarà approssimativamente del 90%-95% di ritenzione. 3. Definire la migliore concentrazione e i migliori rapporti per gli antigeni marcati con biotina e Ru Sulfo-NHS per il test ECL 6-Plex (test a scacchiera) NOTA: Il test a scacchiera per ciascun antigene è necessario prima dell’integrazione nel test multiplexato. Applicare separatamente il test a scacchiera per ciascun antigene.NOTA: passaggi 3.2.-3.7. utilizzerà TGA come breve esempio. Il processo di analisi a scacchiera TGA consiste nel simulare il processo di analisi, ma con un solo tipo di antigene. Effettuare la diluizione seriale del tTG biotinilato e del tTG marcato con Ru Sulfo-NHS. Le concentrazioni di lavoro raccomandate della prima soluzione di miscela partono da 240 ng/mL sia per il tTG biotinilato che per il tTG marcato con Ru Sulfo-NHS. Supponiamo che le concentrazioni di entrambi i tTG originali biotinilati e marcati con Ru Sulfo-NHS siano 1,0 μg / μL. Effettuare una diluizione 10x del tTG originale marcato con Ru Sulfo-NHS e una diluizione 5x del tTG biotinilato originale con BSA al 5%. Mescolare 4 μL di proteina tTG biotinilata con 156 μL di 5% BSA (tampone antigenetico) e 240 μL del linker coniugato con streptavidina in una provetta e incubare la soluzione a RT per 30 minuti. Quindi, aggiungere 160 μL di soluzione di arresto e incubare a RT per altri 30 minuti. Prelevare 400 μL della miscela e mescolare con 2 mL di soluzione di arresto. La concentrazione del tTG biotinilato nella miscela è di 240 ng/ml. Per effettuare una diluizione seriale per l’antigene ZnT8 marcato con biotina, preparare altre cinque nuove provette, prelevare 1 mL di aliquota dalla miscela al punto 3.3. e mescolare con 1 mL di soluzione di arresto in un nuovo tubo e ottenere la miscela con una concentrazione di 120 ng/mL. Ripetere questo passaggio, effettuare diluizioni seriali 1: 1 e ottenere il tTG marcato con biotina a 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL e 7,5 ng / mL. Aggiungere 4 μL di tTG marcato con Ru Sulfo-NHS con 1,6 mL di soluzione di arresto e ottenere una miscela di tTG marcato con Ru Sulfo-NHS ad una concentrazione di 240 ng / mL. Con gli stessi passaggi di 3.4., effettuare diluizioni seriali 1: 1 e ottenere l’antigene ZnT8 marcato con Ru Sulfo-NHS a 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL, 7,5 ng / mL e 3,75 ng / mL. L’ultima concentrazione è 0 ng / mL, con solo soluzione di arresto e nessun antigene marcato con Ru Sulfo-NHS. Preparare campioni di siero di controllo positivo e negativo tTG (pre-qualificati e standardizzati da un singolo test ECL tTG) e una piastra PCR a 96 pozzetti. Aliquotare i campioni di siero di controllo positivo e negativo rispettivamente alla metà sinistra e alla metà destra della piastra con 7 μL in ciascun pozzetto. Aggiungere 1x PBS alla piastra, con 33 μL per pozzetto. Sulla metà sinistra della piastra PCR, aggiungere 24 μL della soluzione seriale di tTG-linker marcata con biotina diluita a ciascun pozzetto, una colonna con una concentrazione in ordine dal più alto al più basso. Allo stesso modo, aggiungere 16 μL dell’antigene tTG diluito Ru Sulfo-NHS seriale a ciascun pozzetto, una fila con una concentrazione, e quindi mescolare accuratamente. Ripetere il passaggio sulla metà destra della piastra PCR. Continuare le altre fasi del test descritte nei punti 5.3.-9.1. fino ad ottenere i dati grezzi di conteggio. Calcola i rapporti tra segnali di controllo positivi e corrispondenti segnali di controllo negativi. Determinare la migliore concentrazione per l’antigene marcato con biotina e l’antigene marcato con Ru Sulfo-NHS con valori di rapporto più elevati e sfondo inferiore per il campione di controllo negativo. Le concentrazioni ottimali di lavoro della biotina e della proteina antigenica marcata con Ru Sulfo-NHS sono mostrate di seguito: 16,0 ng / mL e 8,0 ng / mL per GAD65, 18,8 ng / mL e 9,4 ng / mL per SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / mL e 42,0 ng / mL per IA-2, 60,0 ng / mL e 60,0 ng / mL per tTG, 4,2 ng / mL e 4,2 ng / mL per ZnT8, e 31,3 ng/ml e 31,3 ng/ml per la proinsulina. 4. Creare una soluzione antigene accoppiata a linker Diluire gli antigeni marcati con biotina e Ru Sulfo-NHS con BSA al 5% alle concentrazioni di lavoro ottimali secondo la fase 3.9. Legare i linker preselezionati a ciascuna proteina dell’antigene biotinilato. Per un test su piastra a 96 pozzetti, aggiungere 4 μL di GAD65 biotinilato, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proteina dell’antigene proinsulina in una provetta separata contenente 156 μL di BSA all’1% e mescolare con 240 μL dei corrispondenti linker coniugati con streptavidina 1, 2, 3, 8, 9 e 10 (Figura 1). Incubare la miscela per 30 minuti a RT. Aliquot 160 μL di soluzione di arresto in ciascuna provetta e incubare la miscela a RT per 30 minuti. Estrarre 400 μL della soluzione di miscela da ciascun tubo e combinarli insieme. Aggiungere 4 μL di Ru Sulfo-NHS marcato GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antigene proinsulina alla miscela sopra, quindi aggiungere 1,6 ml di soluzione di arresto e 3,2 ml di 1x PBS e miscelare. Ora la soluzione dell’antigene è pronta per l’uso nel test. 5. Incubare campioni di siero con l’antigene marcato Aliquot 7 μL di siero per pozzetto per una piastra PCR a 96 pozzetti e coperchio con pellicola sigillante. Preriscaldare i sieri a 56 °C per 30 minuti su una macchina PCR. Centrifugare brevemente la piastra a 100 x g per 1 min. Aggiungere 63 μL di soluzione di antigene (preparata al punto 4.4) per pozzetto e mescolare con i sieri. Coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce. Agitare la piastra su uno shaker a 450 rpm a RT per 2 ore e quindi incubare la piastra a 4 °C per 18-24 h. 6. Preparare la piastra 6-Plex Prelevare una piastra 6-Plex dal frigorifero a 4 °C, consentendo alla piastra di arrivare a RT. Aggiungere 150 μL di 3% Blocker A a ciascun pozzetto della piastra 6-Plex. Riporre la piastra in frigorifero a 4 °C, coprire la piastra con un foglio evitando la luce e incubare per una notte.NOTA: le fasi di analisi del Giorno 1 includono le sezioni 4.-6. 7. Trasferire siero/antigene incubati nella piastra 6-Plex Il giorno dopo, prendere la piastra 6-Plex di incubazione dal frigorifero e scaricare tutto il buffer fuori dalla piastra. Picchiettare il piatto su carta assorbente per asciugare. Lavare la piastra 6-Plex 3x con 150 μL di tampone di lavaggio per pozzetto ogni volta. Asciugare la piastra su tovaglioli di carta e incubare siero/antigene aliquote da ciascun pozzetto della piastra PCR di incubazione notturna in due pozzetti della piastra 6-Plex (30 μL per pozzetto per duplicati). Coprire la piastra con un foglio, quindi mettere la piastra su uno scuotitore e agitare con una velocità di 450 giri / min a RT per 1 ora. 8. Lavare la piastra 6-Plex e aggiungere il buffer di lettura Scaricare la soluzione nella piastra 6-Plex e lavare la piastra 3 volte con 150 μL di tampone di lavaggio NaCl da 0,4 M per pozzetto. Al termine del terzo lavaggio, asciugare la piastra contro il tovagliolo di carta e aggiungere 150 μL di tampone di lettura in ciascun pozzetto.NOTA: le bolle d’aria nel pozzo influiscono sulla precisione della macchina del lettore di piastre e dovrebbero essere evitate a tutti i costi. 9. Leggi la targa e analizza i dati Contare la piastra su un analizzatore di elettrochemiluminescenza. I risultati della lettura verranno presentati con i valori in conteggi al secondo (CPS). Calcolare l’indice anticorpale relativo di ciascun campione utilizzando il CPS grezzo ottenuto dalla macchina di lettura rispetto al CPS dei controlli standard interni positivi e negativi di ciascun anticorpo specifico (valore indice = [CPS (campione) – CPS (standard negativo)] / [CPS (standard positivo) – CPS (standard negativo)]). Determinare i risultati negativi o positivi degli anticorpi utilizzando i valori di cutoff che sono stati stabiliti al 99,5 ° al 99,8° percentile di 555 campioni di controllo negativi dallo studio ASK (tutti i campioni negativi agli anticorpi senza una storia o storia familiare di diabete o qualsiasi altro tipo di malattia autoimmune).NOTA: le fasi di analisi del Giorno 2 includono le sezioni 7-9.