הקרנה מרובת תפוקה גבוהה לסוכרת מסוג 1, מחלות צליאק ו-COVID-19

פרוטוקול המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית המרובים של קולורדו. 1. הכנת חיץ הכן את מאגר הסימון (2x PBS, pH 7.9): הוסף 100 מ”ל של 10x PBS ל-400 מ”ל של מים מזוקקים וכוונן את ה-pH באמצעות NaOH ל-7.9. הכינו 3 מ”מ של ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS: המיסו 1 מ”ג ביוטין ב-588 מיקרו-ליטר של חיץ תיוג והמיסו 150 ננומול של Ru Sulfo-NHS ב-50 μL של חיץ התוויה. הכן את מאגר האנטיגן (1% BSA): המיס 5 גרם של אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-500 מ”ל של PBS אחד. הכן את מאגר הציפוי (3% חוסם A): המסה של 15 גרם חוסם A ב-500 מ”ל של PBS אחד. הכינו את חיץ הכביסה הראשון (0.05% Tween 20, PBST): ערבבו 2.5 מ”ל של Tween 20 ב-5,000 מ”ל של PBS אחד. הכינו את חיץ הכביסה השני (0.4 מ’ NaCl): ערבבו 50 מ”ל של 5 מ”ל NaCl ב-575 מ”ל מים מזוקקים כדי ליצור את תמיסת NaCl של 0.4 מ’.הערה: לתיוג יעיל, השתמש תמיד בתמיסות ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS טריות ולא בתמיסות מאוחסנות שיוצרו בעבר. 2. תיוג חלבון אנטיגן עם ביוטין ו- Ru Sulfo-NHS בנפרד הערה: ריכוז גבוה יותר של חלבון אנטיגן ≥0.5 מ”ג/מ”ל מומלץ ליעילות תיוג גבוהה יותר. הכן שש תמיסות חלבון אנטיגן ממוקדות, כולל פרואינסולין, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG ותחום קשירת קולטנים (RBD) של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. חשב את השומות של כל חלבון אנטיגן על פי המשקל המולקולרי שלו ובצע יחסים טוחנות מתאימים של ביוטין או Ru Sulfo-NHS. היחס בין אנטיגן לסכום הביוטין או Ru Sulfo-NHS יהיה 1:5 עבור אנטיגנים מולקולריים קטנים (משקל מולקולרי ≤10 kd), כגון חלבון פרואינסולין. עבור אנטיגנים מולקולריים בינוניים (משקל מולקולרי 10-50 kd), כגון ZnT8, היחס יתאים את עצמו ל-1:10. עבור אנטיגנים בעלי משקל מולקולרי גדול (משקל מולקולרי >50 kd), כגון GAD, יחס הטוחנות יהיה 1:20. חלקו את חלבון האנטיגן לשני חלקים שווים וערבבו אותו בנפרד עם ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS באמצעות יחס טוחנות מחושב בשלב 2.1. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה וחצי, תוך הימנעות מאור.הערה: יש להסיר את כל הכימיקלים המפחיתים כגון טריס או גליצין במאגר של חלבון אנטיגן על ידי עמודת ספין בגודל עם חיץ של 2x PBS (pH 7.9). הגדילו את עמודות הספין עם 2x PBS (גודל עמודת הספין, 2 מ”ל או 5 מ”ל, תלוי בנפח חלבון האנטיגן המתויג): הוסיפו 1 מ”ל של מאגר PBS 2x לעמודת הספין, עשו צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות, וחזרו על השלב פי 2 יותר. תנו לתערובת חלבון האנטיגן-ביוטין או -Ru Sulfo-NHS לעבור דרך עמודת הספין הראשונית 1x (צנטריפוגה של העמודה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות) כדי לטהר ולעצור את תגובת התיוג. מדוד את הנפח הסופי של חלבון האנטיגן המסומן המסומן מעמודות הספין, תוך חישוב הריכוזים של חלבון אנטיגן המסומן בביוטין או Ru Sulfo-NHS. הכינו אליקוטים קטנים יותר של חלבון אנטיגן מסומן (50 μL/tube) ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80°C- לשימוש ארוך טווח.הערה: הכיסוי של חלבון לאחר כל עמודת ספין יהיה כ-90%-95% אחוזי שמירה. 3. הגדר את הריכוז והיחסים הטובים ביותר עבור אנטיגנים המסומנים בביוטין וברו סולפו-NHS עבור בדיקת ECL 6-Plex (בדיקת לוח משבצות) הערה: בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן נחוצה לפני שילוב בבדיקה המורכבת. החל את בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן בנפרד.הערה: שלבים 3.2.-3.7. ישתמש ב- TGA כדוגמה קצרה. תהליך הבדיקה של לוח המשבצות של TGA נועד לדמות את תהליך הבדיקה אך עם סוג אחד בלבד של אנטיגן. בצע את הדילול הסדרתי של tTG שעבר ביוטינילציה ו- Ru Sulfo-NHS שכותרתו tTG. ריכוזי העבודה המומלצים של תמיסת התערובת הראשונה מתחילים מ-240 ננוגרם/מ”ל הן עבור tTG שעבר ביוטינילציה והן עבור tTG עם תווית Ru Sulfo-NHS. נניח שהריכוזים של tTG המקורי וה-Ru Sulfo-NHS הם 1.0 מיקרוגרם/μL. בצע דילול של פי 10 של ה-tTG המקורי עם התווית Ru Sulfo-NHS ודילול של פי 5 של ה-tTG המקורי עם 5% BSA. יש לערבב 4 μL של חלבון tTG שעבר ביוטינילציה עם 156 μL של 5% BSA (חיץ אנטיגן) ו-240 μL של המקשר המצומד לסטרפטווידין בצינור אחד ולדגור את התמיסה ב-RT למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 160 μL של תמיסת עצירה, ודגירה ב- RT למשך 30 דקות נוספות. קח 400 μL של התערובת ומערבבים עם 2 מ”ל של תמיסת עצירה. הריכוז של tTG שעבר ביוטינילציה בתערובת הוא 240 ננוגרם/מ”ל. כדי לבצע דילול סדרתי לאנטיגן ZnT8 עם תווית ביוטין, הכינו עוד חמש שפופרות חדשות, קחו 1 מ”ל של אליקוט מהתערובת בשלב 3.3. ומערבבים עם 1 מ”ל של תמיסת עצירה בצינור חדש, ומקבלים את התערובת בריכוז של 120 ננוגרם/מ”ל. חזור על שלב זה, בצע דילולים סדרתיים של 1:1, וקבל את ה-tTG עם תווית הביוטין ב-60 ננוגרם/מ”ל, 30 ננוגרם/מ”ל, 15 ננוגרם/מ”ל ו-7.5 ננוגרם/מ”ל. הוסף 4 μL של Ru Sulfo-NHS עם תווית tTG עם 1.6 מ”ל של תמיסת עצירה, וקבל תערובת של Ru Sulfo-NHS עם תווית tTG בריכוז של 240 ננוגרם/מ”ל. עם אותם שלבים של 3.4., בצע דילולים סדרתיים של 1:1 וקבל את האנטיגן ZnT8 המסומן ב- Ru Sulfo-NHS ב- 60 ng/mL, 30 ng/mL, 15 ng/mL, 7.5 ng/mL ו-3.75 ng/mL. הריכוז האחרון הוא 0 ng/mL, עם תמיסת עצירה בלבד וללא אנטיגן עם תווית Ru Sulfo-NHS. הכן דגימות סרום בקרה חיובית ובקרה שלילית של tTG (מאושרות מראש ומתוקננות על ידי בדיקת ECL tTG יחידה) וצלחת PCR של 96 בארות. Aliquot את דגימות סרום הבקרה החיוביות והשליליות למחצית השמאלית והימנית של הצלחת, בהתאמה, עם 7 μL בכל באר. הוסיפו 1x PBS לצלחת, עם 33 μL לכל באר. במחצית השמאלית של לוחית ה-PCR, הוסיפו 24 μL של תמיסת tTG-linker טורית מדוללת עם תווית ביוטין לכל באר, עמודה אחת עם ריכוז אחד בסדר של הגבוה ביותר לנמוך ביותר. באותו אופן, להוסיף 16 μL של סדרתי מדולל Ru Sulfo-NHS שכותרתו אנטיגן tTG לכל באר, שורה אחת עם ריכוז אחד, ולאחר מכן לערבב היטב. חזור על השלב על החצי הימני של צלחת ה- PCR. המשך את שאר שלבי הבדיקה המתוארים בשלבים 5.3.-9.1. עד לקבלת נתוני הספירה הגולמיים. חשב את היחסים בין אותות בקרה חיוביים לאותות בקרה שליליים תואמים. קבע את הריכוז הטוב ביותר עבור האנטיגן המסומן בביוטין והאנטיגן המסומן Ru Sulfo-NHS עם ערכי יחס גבוהים יותר ורקע נמוך יותר עבור דגימת הבקרה השלילית. ריכוזי העבודה האופטימליים של ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS המסומנים כחלבון אנטיגן מוצגים להלן: 16.0 נ”ג/מ”ל ו-8.0 נ”ג/מ”ל עבור GAD65, 18.8 נ”ג/מ”ל ו-9.4 נ”ג/מ”ל עבור SARS-CoV-2 RBD, 42.0 נ”ג/מ”ל ו-42.0 נ”ג/מ”ל עבור IA-2, 60.0 נ”ג/מ”ל ו-60.0 נ”ג/מ”ל עבור tTG, 4.2 נ”ג/מ”ל ו-4.2 נ”ג/מ”ל עבור ZnT8, ו-31.3 נ”ג/מ”ל ו-31.3 נ”ג/מ”ל לפרוזולין. 4. צור פתרון אנטיגן מצומד מקשר דלל את האנטיגנים המסומנים בביוטין וב-Ru Sulfo-NHS עם 5% BSA לריכוזי העבודה האופטימליים בהתאם לשלב 3.9. קשירת מקשרים שנבחרו מראש לכל חלבון אנטיגן שעבר ביוטינילציה. עבור בדיקת צלחת אחת של 96 בארות, הוסף 4 μL של GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 וחלבון אנטיגן פרוינסולין לצינור נפרד המכיל 156 μL של 1% BSA וערבב עם 240 μL של המקשרים המצומדים המתאימים לסטרפטווידין 1, 2, 3, 8, 9 ו-10 (איור 1). לדגור את התערובת במשך 30 דקות ב- RT. Aliquot 160 μL של תמיסת עצירה בכל צינור ודגירה של התערובת ב- RT למשך 30 דקות. הוציאו 400 מיקרון של תמיסת התערובת מכל צינור ושלבו אותם יחד. הוסף 4 μL של Ru Sulfo-NHS שכותרתו GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ואנטיגן פרואינסולין לתערובת לעיל, ולאחר מכן הוסף 1.6 מ”ל של תמיסת עצירה ו-3.2 מ”ל של PBS ותערובת אחת. עכשיו פתרון האנטיגן מוכן לשימוש בבדיקה. 5. דגירה דגימות סרום עם האנטיגן המסומן Aliquot 7 μL של סרום לכל באר עבור צלחת PCR 96 באר לכסות עם סרט איטום. מחממים את הסרה בטמפרטורה של 56 מעלות למשך 30 דקות במכונת PCR. צנטריפוגה קצרה את הצלחת ב 100 x גרם במשך 1 דקה. מוסיפים 63 μL של תמיסת אנטיגן (מוכנה בשלב 4.4) לכל באר, ומערבבים עם הסרה. כסו את לוחית ה-PCR בנייר כסף לאיטום כדי למנוע אור. נערו את הצלחת על שייקר ב-450 סל”ד ב-RT למשך שעתיים ולאחר מכן דגרו את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות. 6. מכינים את צלחת ה-6 פלקס קח צלחת 6-Plex מהמקרר 4 מעלות צלזיוס, ואפשר לצלחת להגיע ל- RT. הוסף 150 מיקרוגרם של 3% חוסם A לכל באר של צלחת 6-Plex. מחזירים את הצלחת למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מכסים את הצלחת בנייר כסף ונמנעים מאור, ודוגרים למשך הלילה.הערה: שלבי הבדיקה ביום 1 כוללים את סעיפים 4.-6. 7. מעבירים דגירה של סרום/אנטיגן לצלחת 6-Plex למחרת, הוציאו את צלחת ה-6-Plex מהמקרר וזרקו את כל החיץ מהצלחת. טפחו את הצלחת על מגבות נייר לייבוש. שטפו את צלחת ה-6 Plex 3x עם 150 מיקרון ליטר של חיץ כביסה בכל באר בכל פעם. מייבשים את הצלחת על מגבות נייר, וסרום/אנטיגן aliquot דוגר מכל באר של צלחת ה-PCR הדוגרה למשך הלילה לשתי בארות של צלחת 6-Plex (30 מיקרו-ליטר לבאר לכפילויות). מכסים את הצלחת בנייר כסף, ואז מניחים את הצלחת על שייקר צלחת, ומנערים במהירות של 450 סל”ד ב-RT למשך שעה אחת. 8. שוטפים את צלחת ה-6 Plex ומוסיפים את מאגר הקריאה השליכו את התמיסה לצלחת 6-Plex ושטפו את הצלחת פי 3 עם 150 מיקרון ליטר של 0.4 M NaCl חיץ כביסה לכל באר בכל פעם. לאחר השלמת הכביסה השלישית, ייבשו את הצלחת כנגד מגבת הנייר והוסיפו 150 מיקרוגרם קריאה לכל באר.הערה: בועות אוויר בבאר משפיעות על הדיוק של מכונת קורא הצלחות ויש להימנע מהן בכל מחיר. 9. קרא את הצלחת ונתח את הנתונים לספור את הצלחת על מנתח electrochemiluminescence. תוצאות הקריאה יוצגו עם הערכים בספירות לשנייה (CPS). חשב את מדד הנוגדנים היחסי של כל דגימה באמצעות ה- CPS הגולמי המתקבל ממכונת הקריאה כנגד ה- CPS של הבקרות החיוביות והשליליות הסטנדרטיות הפנימיות של כל נוגדן ספציפי (ערך אינדקס = [CPS (מדגם) – CPS (תקן שלילי)] / [CPS (תקן חיובי) – CPS (תקן שלילי)]). קבע תוצאות נוגדנים שליליות או חיוביות באמצעות ערכי החיתוך שנקבעובאחוזונים 99.5עד 99.8 של 555 דגימות בקרה שליליות ממחקר ASK (כל הנוגדנים דגימות שליליות ללא היסטוריה או היסטוריה משפחתית של סוכרת או כל סוג אחר של מחלה אוטואימונית).הערה: שלבי הבדיקה ביום 2 כוללים את סעיפים 7-9.