Een high-throughput multiplexed screening voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Colorado Multiple Institutional Review Board. 1. Buffervoorbereiding Bereid de etiketteringsbuffer voor (2x PBS, pH 7,9): Voeg 100 ml 10x PBS toe aan 400 ml gedestilleerd water en pas de pH met NaOH aan op 7,9. Maak 3 mM biotine en Ru Sulfo-NHS: Los 1 mg biotine op in 588 μL etiketteringsbuffer en los 150 nmol Ru Sulfo-NHS op in 50 μL etiketteringsbuffer. Bereid de antigeenbuffer (1% BSA): Los 5 g runderserumalbumine (BSA) op in 500 ml 1x PBS. Bereid de coatingbuffer (3% Blocker A): Los 15 g Blocker A op in 500 ml 1x PBS. Bereid de eerste wasbuffer voor (0,05 % Tween 20, PBST): Meng 2,5 ml Tween 20 in 5.000 ml 1x PBS. Bereid de tweede wasbuffer (0,4 M NaCl): Meng 50 ml 5 M NaCl in 575 ml gedestilleerd water om de 0,4 M NaCl-oplossing te maken.OPMERKING: Gebruik voor een efficiënte etikettering altijd vers bereide biotine en Ru Sulfo-NHS-oplossingen en niet opgeslagen oplossingen die eerder zijn gemaakt. 2. Antigeen eiwitetikettering met biotine en Ru Sulfo-NHS afzonderlijk OPMERKING: Een hogere concentratie antigeeneiwit ≥0,5 mg / ml wordt aanbevolen voor een hogere etiketteringsefficiëntie. Bereid zes gerichte antigeeneiwitoplossingen, waaronder proinsuline, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG en receptorbindingsdomein (RBD) van het spike-eiwit van SARS-CoV-2. Bereken de mol van elk antigeeneiwit op basis van het molecuulgewicht en maak de juiste molaire verhoudingen van biotine of Ru Sulfo-NHS. De verhouding van antigeen tot de som van biotine of Ru Sulfo-NHS zal 1:5 zijn voor kleine moleculaire antigenen (molecuulgewicht ≤10 kd), zoals proinsuline-eiwit. Voor middelgrote moleculaire antigenen (molecuulgewicht 10-50 kd), zoals ZnT8, zal de verhouding zich aanpassen aan 1:10. Voor antigenen met een groot molecuulgewicht (molecuulgewicht >50 kd), zoals GAD, is de molaire verhouding 1:20. Verdeel het antigeeneiwit in twee gelijke delen en meng het afzonderlijk met biotine en Ru Sulfo-NHS met behulp van de berekende molaire verhouding in stap 2.1. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1,5 uur en vermijd licht.OPMERKING: Alle reducerende chemicaliën zoals de Tris of glycine in de buffer van antigeeneiwit moeten worden verwijderd door een maatspinkolom geprimed met een buffer van 2x PBS (pH 7,9). Prime de spinkolommen met 2x PBS (de grootte van de spinkolom, 2 ml of 5 ml, hangt af van het volume van het etiketteerantigeeneiwit): voeg 1 ml 2x PBS-buffer toe aan de spinkolom, centrifugeer het op 1.000 x g gedurende 2 minuten en herhaal de stap 2x meer. Laat het antigeen eiwit-biotine of -Ru Sulfo-NHS mengsel 1x door de geprimeerde spinkolom gaan (centrifugeer de kolom op 1.000 x g gedurende 2 min) om te zuiveren en de etiketteringsreactie te stoppen. Meet het uiteindelijke volume van het gelabelde antigeeneiwit dat uit de spinkolommen is geëlueerd en bereken de concentraties van biotine- of Ru Sulfo-NHS-gelabeld antigeeneiwit. Maak kleinere aliquots van gelabeld antigeeneiwit (50 μL/tube) en bewaar ze bij −80 °C voor langdurig gebruik.OPMERKING: De dekking van eiwitten na elke spinkolom is een retentiepercentage van ongeveer 90% -95%. 3. Definieer de beste concentratie en verhoudingen voor biotine- en Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen voor de 6-Plex ECL-test (dambordtest) OPMERKING: De dambordtest voor elk antigeen is noodzakelijk voordat de multiplextest wordt geïntegreerd. Pas de dambordtest voor elk antigeen afzonderlijk toe.OPMERKING: Stappen 3.2.-3.7. zal TGA als een kort voorbeeld gebruiken. Het TGA-dambordtestproces is om het testproces te simuleren, maar met slechts één soort antigeen. Maak de seriële verdunning van de gebiotinyleerde tTG en Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG. De aanbevolen werkconcentraties van de eerste mengseloplossing beginnen bij 240 ng /ml voor zowel gebiotinyleerd als Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG. Stel dat de concentraties van zowel de oorspronkelijke gebiotinyleerde als de Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG 1,0 μg/μL zijn. Maak een 10x verdunning van de originele Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG en een 5x verdunning van de oorspronkelijke gebiotinyleerde tTG met 5% BSA. Meng 4 μL gebiotinyleerd tTG-eiwit met 156 μL 5% BSA (antigeenbuffer) en 240 μL van de geconjugeerde linker in één buis en incubeer de oplossing bij RT gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 160 μL stopoplossing toe en incubeer nog eens 30 minuten bij RT. Neem 400 μL van het mengsel en meng met 2 ml stopoplossing. De concentratie van de gebiotinyleerde tTG in het mengsel is 240 ng/ml. Om een seriële verdunning te maken voor biotine-gelabeld ZnT8-antigeen, bereidt u nog eens vijf nieuwe buizen voor, neemt u 1 ml van een aliquot uit het mengsel in stap 3.3. en meng met 1 ml stopoplossing in een nieuwe buis en krijg het mengsel met een concentratie van 120 ng / ml. Herhaal deze stap, maak seriële 1:1 verdunningen en krijg de biotine-gelabelde tTG op 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml en 7,5 ng / ml. Voeg 4 μL Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG toe met 1,6 ml stopoplossing en krijg een mengsel van Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG in een concentratie van 240 ng / ml. Maak met dezelfde stappen van 3.4. seriële 1:1 verdunningen en krijg het Ru Sulfo-NHS-gelabelde ZnT8-antigeen op 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml en 3,75 ng / ml. De laatste concentratie is 0 ng/ml, met alleen stopoplossing en geen Ru Sulfo-NHS-gelabeld antigeen. Bereid tTG positieve controle en negatieve controle serummonsters (vooraf gekwalificeerd en gestandaardiseerd door een enkele ECL tTG-test) en een 96-well PCR-plaat. Voeg de positieve en negatieve controleserummonsters toe aan respectievelijk de linkerhelft en de rechterhelft van de plaat, met 7 μL in elk putje. Voeg 1x PBS toe aan de plaat, met 33 μL per putje. Voeg op de linkerhelft van de PCR-plaat 24 μL van de serieel verdunde biotine-gelabelde tTG-linkeroplossing toe aan elke put, één kolom met één concentratie in volgorde van hoog tot laag. Voeg op dezelfde manier 16 μL van het serieel verdunde Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG-antigeen toe aan elke put, één rij met één concentratie en meng vervolgens grondig. Herhaal de stap op de rechterhelft van de PCR-plaat. Ga verder met de rest van de teststappen die worden beschreven in stap 5.3.-9.1. totdat de ruwe telgegevens zijn verkregen. Bereken de verhoudingen van positieve besturingssignalen tot overeenkomstige negatieve besturingssignalen. Bepaal de beste concentratie voor het biotine-gelabelde antigeen en het Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigeen met hogere ratiowaarden en lagere achtergrond voor het negatieve controlemonster. De optimale werkconcentraties van biotine en Ru Sulfo-NHS gelabeld antigeeneiwit worden hieronder weergegeven: 16,0 ng / ml en 8,0 ng / ml voor GAD65, 18,8 ng / ml en 9,4 ng / ml voor SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / ml en 42,0 ng / ml voor IA-2, 60,0 ng / ml en 60,0 ng / ml voor tTG, 4,2 ng / ml en 4,2 ng / ml voor ZnT8, en 31,3 ng/ml en 31,3 ng/ml voor pro-insuline. 4. Maak linker-gekoppelde antigeenoplossing Verdun de biotine- en Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen met 5% BSA tot de optimale werkconcentraties volgens stap 3.9. Bind vooraf geselecteerde linkers aan elk gebiotinyleerd antigeeneiwit. Voeg voor een 96-wells plaattest 4 μL gebiotinyleerd GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline antigeeneiwit toe aan een afzonderlijke buis met 156 μL van 1% BSA en meng met 240 μL overeenkomstige streptavidin-geconjugeerde linkers 1, 2, 3, 8, 9 en 10 (figuur 1). Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij RT. Aliquot 160 μL stopoplossing in elke buis en incubeer het mengsel bij RT gedurende 30 minuten. Haal 400 μL van de mengseloplossing uit elke buis en combineer ze samen. Voeg 4 μL Ru Sulfo-NHS met het label GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline-antigeen toe aan het bovenstaande mengsel en voeg vervolgens 1,6 ml stopoplossing en 3,2 ml 1x PBS toe en meng. Nu is de antigeenoplossing klaar voor gebruik in de test. 5. Incubeer serummonsters met het gelabelde antigeen Aliquot 7 μL serum per putje voor een 96-well PCR plaat en afdek met afdichtingsfolie. Verwarm de sera gedurende 30 minuten voor op 56 °C op een PCR-machine. Centrifugeer de plaat kort op 100 x g gedurende 1 min. Voeg 63 μL antigeenoplossing (bereid in stap 4.4) per putje toe en meng met de sera. Bedek de PCR-plaat met afdichtingsfolie om licht te voorkomen. Schud de plaat op een shaker bij 450 rpm bij RT gedurende 2 uur en incubeer de plaat vervolgens bij 4 °C gedurende 18-24 uur. 6. Bereid de 6-Plex plaat voor Neem een 6-Plex plaat uit de 4 °C koelkast, zodat de plaat naar RT kan komen. Voeg 150 μL 3% Blocker A toe aan elk putje van de 6-Plex plaat. Zet de plaat terug in de koelkast van 4 °C, bedek de plaat met folie die licht vermijdt en incubeer een nacht.OPMERKING: Teststappen in dag 1 omvatten secties 4.-6. 7. Breng serum/antigeen over in de 6-Plex plaat Neem de volgende dag de broedende 6-Plex plaat uit de koelkast en gooi alle buffer uit de plaat. Dep het bord op keukenpapier om uit te drogen. Was de 6-Plex plaat 3x met telkens 150 μL wasbuffer per putje. Droog de plaat op keukenpapier en aliquot serum / antigeen incubeert uit elke put van de nachtelijke broedende PCR-plaat in twee putjes van de 6-Plex-plaat (30 μL per putje voor duplicaten). Bedek de plaat met folie, leg de plaat vervolgens op een platenschudder en schud met een snelheid van 450 tpm bij RT gedurende 1 uur. 8. Was de 6-Plex plaat en voeg leesbuffer toe Dump de oplossing in de 6-Plex plaat en was de plaat 3x met 150 μL van 0,4 M NaCl wasbuffer per putje per keer. Nadat de derde wasbeurt is voltooid, droogt u de plaat tegen het keukenpapier en voegt u 150 μL leesbuffer toe aan elk putje.OPMERKING: Luchtbellen in de put beïnvloeden de nauwkeurigheid van de plaatlezermachine en moeten ten koste van alles worden vermeden. 9. Lees de plaat en analyseer de gegevens Tel de plaat op een elektrochemiluminescentieanalysator. De leesresultaten worden gepresenteerd met de waarden in tellingen per seconde (CPS). Bereken de relatieve antilichaamindex van elk monster met behulp van de ruwe CPS verkregen uit de leesmachine tegen de CPS van de interne standaard positieve en negatieve controles van elk specifiek antilichaam (Indexwaarde = [CPS (monster) – CPS (negatieve standaard)] / [CPS (positieve standaard) – CPS (negatieve standaard)]). Bepaal negatieve of positieve antilichaamresultaten met behulp van de cutoff-waarden die zijn vastgesteld op de 99,5tot 99,8e percentielen van 555 negatieve controlemonsters uit de ASK-studie (alle antilichamen negatieve monsters zonder een voorgeschiedenis of familiegeschiedenis van diabetes of een ander type auto-immuunziekte).OPMERKING: Teststappen in dag 2 omvatten secties 7-9.