İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi
Summary
Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM’ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kütle spektrometresi, translasyonel modifikasyonların (PTM’ler) derin kapsamını sağlayabilir, ancak bu modifikasyonların karmaşık biyolojik matrislerden zenginleştirilmesi, modifiye edilmemiş analitlere kıyasla düşük stokiyometrileri nedeniyle sıklıkla gereklidir. Elde edilen peptitler analiz edilmeden önce proteinlerin enzimatik olarak sindirildiği aşağıdan yukarıya proteomik iş akışlarında peptitler üzerindeki PTM’lerin çoğu zenginleştirme iş akışı, yalnızca bir tür modifikasyonu zenginleştirir. Bununla birlikte, biyolojik fonksiyonlara yol açan PTM’lerin tüm tamamlayıcısıdır ve tek bir PTM tipinin zenginleştirilmesi, PTM’lerin bu tür çapraz konuşmasını kaçırabilir. PTM çapraz konuşması, protein glikozilasyonu ve fosforilasyon, insan proteinlerindeki en yaygın iki PTM ve ayrıca kütle spektrometrisi iş akışlarını kullanan en çok çalışılan iki PTM arasında gözlenmiştir. Burada açıklanan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi kullanılarak, her iki PTM de karmaşık bir biyolojik matris olan ölüm sonrası insan pankreas dokusundan zenginleştirilmiştir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisi, uygun bir spin ucu tabanlı yöntemle çoklu fraksiyonlarda aynı anda çeşitli glikozilasyon ve fosforilasyon formlarını ayırmak için kullanılır ve potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin aşağı akış analizlerine izin verir. Gliko ve fosfopeptitler için bu zenginleştirme iş akışı, birden fazla PTM’nin derin profilini çıkarmak ve gelecekteki çalışmalar için potansiyel hedef molekülleri tanımlamak için çeşitli numune tiplerine uygulanabilir.
Introduction
Protein post-translasyonel modifikasyonları (PTM’ler), protein yapılarının ve dolayısıyla işlevlerinin ve aşağı akış biyolojik süreçlerinin modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. İnsan proteomunun çeşitliliği, çeşitli PTM’lerin sağladığı kombinatoryal değişkenlik nedeniyle katlanarak artar. Genom tarafından tahmin edildiği gibi kanonik dizilerinden farklı protein varyantları proteoformlar olarak bilinir ve birçok proteoform PTM’lerden kaynaklanır1. Sağlık ve hastalıkta proteoform çeşitliliğinin incelenmesi son yıllarda büyük ilgi gören bir araştırma alanı haline gelmiştir 2,3.
Proteoformların ve daha spesifik olarak büyük derinliğe sahip PTM’lerin incelenmesi, kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik yöntemlerin geliştirilmesiyle daha kolay hale gelmiştir. MS kullanılarak, analitler iyonize edilir, parçalanır ve fragmanların m / z’sine göre tanımlanır. Zenginleştirme yöntemleri, PTM’lerin modifiye edilmemiş protein formlarına kıyasla düşük göreceli bolluğu nedeniyle sıklıkla gereklidir. Bozulmamış proteinlerin ve yukarıdan aşağıya analizler olarak adlandırılan PTM’lerinin analizi daha rutin hale gelmiş olsa da, proteinlerin enzimatik sindirimi ve aşağıdan yukarıya analizlerde bileşen peptitlerinin analizi hala PTM analizi için en yaygın kullanılan yoldur. En çok çalışılan iki PTM ve in vivo olarak en yaygın iki PTM, glikozilasyon ve fosforilasyon4’tür. Bu iki PTM, hücre sinyalizasyonu ve tanınmasında önemli rol oynar ve bu nedenle hastalık araştırmalarında karakterize etmek için önemli modifikasyonlardır.
Çeşitli PTM’lerin kimyasal özellikleri genellikle analizden önce protein ve peptit seviyelerinde bu PTM’lerin zenginleştirilmesine yönelik yollar sağlar. Glikozilasyon, her monosakkarit üzerindeki hidroksil gruplarının bolluğu nedeniyle hidrofilik bir PTM’dir. Bu özellik, hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC) glikopeptidleri zenginleştirmek için kullanılabilir, bu da daha fazla hidrofilik glikopeptidi hidrofobik modifiye edilmemiş peptitlerden ayırabilir5. Fosforilasyon, asidik pH dışında negatif yüklü olan fosfat moiety’yi ekler. Bu yük nedeniyle, fosforile edilmemiş türler yıkanırken, fosforeptitleri çekmek ve bağlamak için titanyum da dahil olmak üzere çeşitli metal katyonlar kullanılabilir. Bu, immobilize metal afinite kromatografisinin (IMAC) prensibidir. Glikozilasyon ve fosforilasyon için bu ve diğer zenginleştirme stratejileri hakkında daha fazla tartışma son derlemelerde bulunabilir 6,7.
PTM’lerin peptitler üzerindeki düşük stokiyometrisi nedeniyle zenginleştirme protokolleri için nispeten büyük miktarlarda başlangıç peptid materyaline (0.5 mg veya daha fazla) sıklıkla ihtiyaç duyulur. Tümör çekirdek biyopsisi veya beyin omurilik sıvısı analizleri gibi bu miktarda numunenin kolayca elde edilemeyeceği senaryolarda, maksimum biyomoleküler bilgi ile sonuçlanan kolay iş akışları kullanmak faydalıdır. Laboratuvarımız ve diğerleri tarafından geliştirilen son stratejiler, aynı PTM zenginleştirme iş akışı 8,9,10,11,12 kullanılarak glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı ve paralel analizini vurgulamıştır. Bu iki PTM’nin kimyasal özellikleri farklı olsa da, bu PTM’ler yenilikçi ayırma teknikleri ve kullanılan malzemeler nedeniyle birden fazla adımda analiz edilebilir. Örneğin, elektrostatik itme-hidrofilik etkileşim kromatografisi (ERLIC), analitler ve mobil faz arasındaki hidrofilik etkileşimlere dayanan ayrımları, analitler ve sabit faz malzemesi13,14,15,16 arasındaki yük-yük etkileşimleri ile kaplar. Asidik pH’da, fosforile peptitlerin sabit faza çekilmesi, modifiye edilmemiş peptitlerden tutulmalarını ve ayrılmalarını artırabilir. Hidrofilik mikrosferler üzerinde hareketsiz hale getirilmiş Ti(IV)’den oluşan malzeme, fosfopeptitleri ve nötr, asidik ve mannoz-6-fosforile glikopeptidleri ayırmak için HILIC ve IMAC bazlı elüsyon için kullanılabilir17,18. Bu strateji çift işlevli Ti(IV)-IMAC olarak bilinir. Birden fazla PTM’yi tek bir iş akışında zenginleştirmek için bu stratejileri kullanmak, potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin analizlerini daha erişilebilir hale getirebilir. Ek olarak, toplam numune miktarı ve zaman gereksinimleri, paralel olarak gerçekleştirildiğinde geleneksel zenginleştirme yöntemlerinden daha azdır (yani, ayrı numune alikotlarında HILIC ve IMAC).
Protein glikozilasyonu ve fosforilasyonun eşzamanlı analizi için çift fonksiyonlu Ti (IV) -IMAC stratejisini göstermek için, ölüm sonrası insan pankreas dokularını analiz etmek için uyguladık. Pankreas hem sindirim enzimleri hem de insülin ve glukagon dahil olmak üzere düzenleyici hormonlar üretir. Pankreas hastalığında pankreas fonksiyonu bozulur. Diyabette, kan şekerinin düzenlenmesi etkilenir ve kanda daha yüksek glikoz seviyelerine yol açar. Pankreatitte, inflamasyon organın otomatik sindiriminden kaynaklanır3. Glikozilasyon ve fosforilasyon dahil olmak üzere PTM profillerindeki değişiklikler, sıklıkla olduğu gibi, diğer hastalıklarda da ortaya çıkabilir.
Burada, pankreas dokusundan ekstrakte edilen proteinlerden türetilen N-glikopeptitler ve fosfopeptitler için çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisine dayanan spin-tip tabanlı eşzamanlı zenginleştirme yöntemi için bir protokol tarif ediyoruz. Protokol, Şekil 1’de görülebileceği gibi, protein ekstraksiyonu ve sindirimi, zenginleştirme, MS veri toplama ve veri işlemeyi içerir. Bu çalışmadan elde edilen temsili veriler, PXD033065 tanımlayıcılı ProteomeXchange Konsorsiyumu aracılığıyla edinilebilir.
Şekil 1: İnsan pankreas dokularından N-glikopeptidlerin ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için iş akışı. Dokular, deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak protein ekstraksiyonundan önce ince bir toz haline getirilerek kriyo-toz haline getirilir. Proteinler daha sonra enzimatik sindirime tabi tutulur. Elde edilen peptitler, çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC kullanılarak zenginleştirmeden önce aliquoted edilir. Ham veriler, nano ölçekli ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS) kullanılarak toplanır ve veritabanı arama yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, PTM analizlerini daha erişilebilir hale getirmeyi ve aynı iş akışındaki birden fazla PTM’nin daha yaygın analizini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, hücreler ve biyoakışkanlar dahil olmak üzere diğer karmaşık biyolojik matrislere uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisi, tek bir numune hazırlama iş akışında aynı numuneden N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için kullanışlıdır. ERLIC tabanlı yöntemlerin PTM’lerin eşzamanlı zenginleştirilmesini de sağladığı gösterilmiştir. Her iki strateji de daha önce PTM analizlerinde derin kapsama alanı için kullanılmış14,18. İkili Ti yöntemini, spin uçlarını kullanarak numune inkübasyon süresini az…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen NIH’den (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 ve R21AG065728) ve Çocuk Diyabet Araştırma Vakfı’ndan (1-PNF-2016-250-S-B ve SRA-2016-168-S-B) hibe fonu ile desteklenmiştir. Burada sunulan veriler kısmen Wisconsin Üniversitesi Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü aracılığıyla bir NIH / NCATS UL1TR002373 ödülünün desteğiyle elde edilmiştir. Orbitrap enstrümanları, NIH paylaşımlı enstrüman hibesi (NIH-NCRR S10RR029531) ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi desteği ile satın alındı. Ayrıca, araştırma için insan pankreası sağlayan Wisconsin Üniversitesi Organ ve Doku Bağışı Organizasyonu’nun cömert desteğine ve örnekleri laboratuvarımıza sağlamak için Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett ve Prof. Jon Odorico’nun yardımına teşekkür ederiz. Araştırma ekibimiz bu çalışma için doku bağışında bulunan ailelere özel teşekkürlerini sunar. L.L., Wisconsin Üniversitesi Karkemik Kanser Merkezi’nden (233-AAI9632) bir Pankreas Kanseri Pilot hibesi olan NIH hibesi S10OD025084’ün yanı sıra Wisconsin Mezunları Araştırma Vakfı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından sağlanan fonla Vilas Seçkin Başarı Profesörlüğü ve Charles Melbourne Johnson Seçkin Kürsü Profesörlüğünü kabul etmektedir.
Materials
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 – 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
