Una estrategia de enriquecimiento de spin-tip para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos

Las modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTM) desempeñan un papel importante en la modulación de las estructuras proteicas y, en consecuencia, en sus funciones y procesos biológicos posteriores. La diversidad del proteoma humano aumenta exponencialmente debido a la variabilidad combinatoria que ofrecen varios PTM. Diferentes variantes de proteínas de sus secuencias canónicas predichas por el genoma se conocen como proteoformas, y muchos proteoformas surgen de PTM¹. El estudio de la diversidad proteoforma en salud y enfermedad se ha convertido en un área de investigación de gran interés en los últimos años ^2,3.

El estudio de proteoformas y más específicamente PTM con gran profundidad se ha vuelto más fácil a través del desarrollo de métodos proteómicos basados en espectrometría de masas (EM). Usando EM, los analitos se ionizan, fragmentan e identifican en función de los m /z de los fragmentos. Los métodos de enriquecimiento a menudo son necesarios debido a la baja abundancia relativa de PTM en comparación con las formas no modificadas de proteínas. Aunque el análisis de proteínas intactas y sus PTM, llamados análisis de arriba hacia abajo, se han vuelto más rutinarios, la digestión enzimática de las proteínas y el análisis de sus péptidos componentes en los análisis de abajo hacia arriba sigue siendo la ruta más utilizada para el análisis de PTM. Los dos PTM más ampliamente estudiados, y los dos PTM más comunes in vivo, son la glicosilación y la fosforilación⁴. Estos dos PTM desempeñan un papel importante en la señalización y el reconocimiento celular y, por lo tanto, son modificaciones importantes para caracterizar en la investigación de enfermedades.

Las propiedades químicas de varios PTM a menudo proporcionan rutas hacia el enriquecimiento de estos PTM a nivel de proteínas y péptidos antes del análisis. La glicosilación es un PTM hidrófilo debido a la abundancia de grupos hidroxilo en cada monosacárido. Esta propiedad se puede utilizar para enriquecer glicopéptidos en cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), que puede separar más glicopéptidos hidrófilos de los péptidos hidrofóbicos no modificados⁵. La fosforilación agrega la fracción de fosfato, que está cargada negativamente excepto a pH ácido. Debido a esta carga, se pueden usar varios cationes metálicos, incluido el titanio, para atraer y unir fosfopéptidos mientras que las especies no fosforiladas se eliminan. Este es el principio de la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Se pueden encontrar más discusiones sobre estas y otras estrategias de enriquecimiento para la glicosilación y la fosforilación en revisiones recientes ^6,7.

A menudo se necesitan cantidades comparativamente grandes de material peptídico de partida (0,5 mg o más) para los protocolos de enriquecimiento debido a la baja estequiometría de los PTM en los péptidos. En escenarios en los que esta cantidad de muestra puede no obtenerse fácilmente, como la biopsia del núcleo tumoral o los análisis del líquido cefalorraquídeo, es beneficioso utilizar flujos de trabajo fáciles que den como resultado la máxima información biomolecular. Las estrategias recientes desarrolladas por nuestro laboratorio y otros han destacado el análisis simultáneo y paralelo de la glicosilación y la fosforilación utilizando el mismo flujo de trabajo de enriquecimiento de PTM ^8,9,10,11,12. Aunque las propiedades químicas de estos dos PTM pueden diferir, estos PTM pueden analizarse en múltiples pasos debido a las innovadoras técnicas de separación y materiales utilizados. Por ejemplo, la cromatografía de interacción repulsión-hidrofílica electrostática (ERLIC) superpone separaciones basadas en interacciones hidrófilas entre analitos y la fase móvil con interacciones carga-carga entre analitos y el material de fase estacionaria 13,14,15,16. A pH ácido, la atracción de péptidos fosforilados a la fase estacionaria puede mejorar su retención y separación de péptidos no modificados. El material que consiste en Ti(IV) inmovilizado en microesferas hidrofílicas se puede utilizar para la elución basada en HILIC e IMAC para separar fosfopéptidos y glicopéptidos neutros, ácidos y manosa-6-fosforilados^17,18. Esta estrategia se conoce como Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. El uso de estas estrategias para enriquecer varios PTM en un solo flujo de trabajo puede hacer que los análisis de las posibles interacciones de diafonía de PTM sean más accesibles. Además, la cantidad total de muestra y los requisitos de tiempo son menores que los métodos de enriquecimiento convencionales cuando se realizan en paralelo (es decir, HILIC e IMAC en alícuotas de muestra separadas).

Para demostrar la estrategia dual-funcional Ti(IV)-IMAC para el análisis simultáneo de la glicosilación y fosforilación de proteínas, la hemos aplicado para analizar tejidos pancreáticos humanos post-mortem. El páncreas produce tanto enzimas digestivas como hormonas reguladoras, incluyendo insulina y glucagón. La función pancreática se ve afectada en la enfermedad pancreática. En la diabetes, la regulación del azúcar en la sangre se ve afectada, lo que lleva a niveles más altos de glucosa en la sangre. En la pancreatitis, la inflamación resulta de la autodigestión del órgano³. Los cambios en los perfiles de PTM, incluida la glicosilación y la fosforilación, pueden resultar, como suele ser el caso, en otras enfermedades.

Aquí, describimos un protocolo para un método de enriquecimiento simultáneo basado en punta de espín, basado en una estrategia Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad, para N-glicopéptidos y fosfopéptidos derivados de proteínas extraídas del tejido pancreático. El protocolo incluye extracción y digestión de proteínas, enriquecimiento, recopilación de datos de EM y procesamiento de datos, como se puede ver en la Figura 1. Los datos representativos de este estudio están disponibles a través de ProteomeXchange Consortium con el identificador PXD033065.

Figura 1: Flujo de trabajo para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos. Los tejidos primero se criopulforizan en un polvo fino antes de la extracción de proteínas utilizando el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Las proteínas se someten a digestión enzimática. Los péptidos resultantes se alicitan antes del enriquecimiento utilizando Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. Los datos brutos se recopilan utilizando cromatografía líquida de fase inversa a nanoescala-espectrometría de masas (nRPLC-MS) y se analizan utilizando un software de búsqueda de bases de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo está destinado a hacer que los análisis ptm sean más accesibles y permitir un análisis más generalizado de múltiples PTM en el mismo flujo de trabajo. Este protocolo se puede aplicar a otras matrices biológicas complejas, incluidas las células y los biofluidos.