Uma estratégia de enriquecimento de ponta de spin para análise simultânea de N-glicopeptídeos e Fosfopeptídeos de Tecidos Pancreáticos Humanos

As modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) desempenham um papel importante na modulação das estruturas proteicas e, consequentemente, suas funções e processos biológicos a jusante. A diversidade do proteome humano aumenta exponencialmente devido à variabilidade combinatória proporcionada por vários PTMs. Diferentes variantes de proteínas de suas sequências canônicas como previsto pelo genoma são conhecidas como proteoformas, e muitas proteoformas surgem dos PTMs¹. Estudar a diversidade proteoforme em saúde e doença tornou-se uma área de pesquisa de grande interesse nos últimos anos ^2,3.

O estudo de proteoformes e, mais especificamente, PTMs com grande profundidade tornou-se mais fácil através do desenvolvimento de métodos de proteômica baseados em espectrometria de massa (MS). Utilizando ES, os analitos são ionizados, fragmentados e identificados com base no m/z dos fragmentos. Métodos de enriquecimento são muitas vezes necessários devido à baixa abundância relativa de PTMs em comparação com formas não modificadas de proteínas. Embora a análise de proteínas intactas e seus PTMs, chamados de análises de cima para baixo, tenham se tornado mais rotineiras, a digestão enzimática das proteínas e a análise de seus peptídeos componentes em análises de baixo para cima ainda é o caminho mais utilizado para a análise de PTM. Os dois PTMs mais estudados, e os dois PTMs mais comuns in vivo, são glicosilação e fosforilação⁴. Esses dois PTMs desempenham papéis importantes na sinalização e reconhecimento celular e, portanto, são modificações importantes para caracterizar na pesquisa de doenças.

As propriedades químicas de vários PTMs muitas vezes fornecem rotas para o enriquecimento desses PTMs nos níveis de proteína e peptídeo antes da análise. A glicosylação é um PTM hidrofílico devido à abundância de grupos hidroxis em cada monossacarídeo. Esta propriedade pode ser usada para enriquecer glicopeptídeos na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), que pode separar glicopeptídeos mais hidrofílicos dos peptídeos hidrofóbicos não modificados⁵. A fosforilação adiciona a moiety fosfato, que é negativamente carregada, exceto no pH ácido. Devido a esta carga, várias cálas metálicas, incluindo titânio, podem ser usadas para atrair e ligar fosforpeptídeos enquanto espécies não fosfoiladas são lavadas. Este é o princípio da cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC). Outras discussões sobre essas e outras estratégias de enriquecimento para glicosilação e fosforilação podem ser encontradas em revisões recentes ^6,7.

Quantidades comparativamente grandes de material de peptídeo inicial (0,5 mg ou mais) são frequentemente necessárias para protocolos de enriquecimento devido à baixa estequiometria de PTMs em peptídeos. Em cenários onde essa quantidade de amostra pode não ser facilmente obtida, como biópsia do núcleo tumoral ou análises de fluidos cefalorraquidianos, é benéfico usar fluxos de trabalho fáceis que resultam em informações biomoleculares máximas. Estratégias recentes desenvolvidas pelo nosso laboratório e outras têm destacado a análise simultânea e paralela da glicosilação e fosforilação utilizando o mesmo fluxo de trabalho de enriquecimento ptm 8,9,10,11,12. Embora as propriedades químicas desses dois PTMs possam diferir, esses PTMs podem ser analisados em múltiplas etapas devido às técnicas de separação inovadoras e materiais utilizados. Por exemplo, a cromatografia de interação eletrostática-hidrofílica (ERLIC) sobrepõe separações baseadas em interações hidrofílicas entre analitos e a fase móvel com interações de carga entre analitos e o material de fase estacionária 13,14,15,16. No pH ácido, a atração de peptídeos fosforilalatados para a fase estacionária pode melhorar sua retenção e separação de peptídeos não modificados. O material constituído por Ti(IV) imobilizado em microesferas hidrofílicas pode ser usado para elução baseada em HILIC e IMAC para separar fosforpeptídeos e glicopeptídeos neutros, ácidos e sistoluados-6-fosforilados^17,18. Esta estratégia é conhecida como Ti(IV)-IMAC dual-funcional. O uso dessas estratégias para enriquecer vários PTMs em um único fluxo de trabalho pode tornar as análises de interações potenciais de crosstalk de PTM mais acessíveis. Além disso, o valor total da amostra e os requisitos de tempo são inferiores aos métodos convencionais de enriquecimento quando realizados em paralelo (ou seja, HILIC e IMAC em alíquotas de amostra separadas).

Para demonstrar a estratégia ti(IV)-IMAC dual-funcional para análise simultânea de glicosilação e fosforilação proteica, aplicamos-na para analisar tecidos pancreáticos humanos pós-morte. O pâncreas produz enzimas digestivas e hormônios regulatórios, incluindo insulina e glucagon. A função pancreática é prejudicada em doença pancreática. No diabetes, a regulação do açúcar no sangue é afetada, levando a níveis mais elevados de glicose no sangue. Na pancreatite, a inflamação resulta da auto-digestão do órgão³. Alterações nos perfis de PTM, incluindo glicosilação e fosforilação, podem resultar, como muitas vezes, em outras doenças.

Aqui, descrevemos um protocolo para um método de enriquecimento simultâneo baseado em spin-tip, baseado em uma estratégia ti(IV)-IMAC dual-funcional, para N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos derivados de proteínas extraídas do tecido pancreático. O protocolo inclui extração e digestão de proteínas, enriquecimento, coleta de dados em MS e processamento de dados, como pode ser visto na Figura 1. Os dados representativos deste estudo estão disponíveis via Consórcio ProteomeXchange com o identificador PXD033065.

Figura 1: Fluxo de trabalho para análise simultânea de N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos de tecidos pancreáticos humanos. Os tecidos são primeiro crio-pulverizados em um pó fino antes da extração de proteínas usando o sulfato de dodecyl de sódio detergente (SDS). As proteínas são então submetidas à digestão enzimática. Os peptídeos resultantes são aliquosantes antes do enriquecimento usando Ti(IV)-IMAC dual-funcional. Os dados brutos são coletados usando espectrometria de massa líquida de fase invertida de nanoescala (nRPLC-MS) e são analisados usando software de pesquisa de banco de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo visa tornar as análises de PTM mais acessíveis e permitir uma análise mais difundida de vários PTMs no mesmo fluxo de trabalho. Este protocolo pode ser aplicado a outras matrizes biológicas complexas, incluindo células e biofluidos.