Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe

Protein-posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation von Proteinstrukturen und damit ihrer Funktionen und nachgelagerten biologischen Prozesse. Die Vielfalt des menschlichen Proteoms nimmt aufgrund der kombinatorischen Variabilität verschiedener PTMs exponentiell zu. Verschiedene Varianten von Proteinen aus ihren kanonischen Sequenzen, wie sie vom Genom vorhergesagt werden, werden als Proteoformen bezeichnet, und viele Proteoformen entstehen aus^{PTMs 1}. Die Untersuchung der proteoformen Vielfalt in Gesundheit und Krankheit ist in den letzten Jahren zu einem Forschungsgebiet von großem Interesse^{geworden 2,3}.

Das Studium von Proteoformen und insbesondere von PTMs mit großer Tiefe ist durch die Entwicklung von auf Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomikmethoden einfacher geworden. Mit MS werden Analyten ionisiert, fragmentiert und basierend auf dem m/z von Fragmenten identifiziert. Anreicherungsmethoden sind aufgrund der geringen relativen Häufigkeit von PTMs im Vergleich zu nicht modifizierten Formen von Proteinen oft notwendig. Obwohl die Analyse intakter Proteine und ihrer PTMs, die sogenannten Top-Down-Analysen, routinemäßiger geworden sind, ist die enzymatische Verdauung von Proteinen und die Analyse ihrer Komponentenpeptide in Bottom-up-Analysen immer noch der am weitesten verbreitete Weg für die PTM-Analyse. Die beiden am häufigsten untersuchten PTMs und die beiden häufigsten PTMs in vivo sind Glykosylierung und Phosphorylierung⁴. Diese beiden PTMs spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und -erkennung und sind daher wichtige Modifikationen, die in der Krankheitsforschung charakterisiert werden müssen.

Die chemischen Eigenschaften verschiedener PTMs bieten oft Wege zur Anreicherung dieser PTMs auf Protein- und Peptidebene vor der Analyse. Die Glykosylierung ist ein hydrophiles PTM aufgrund der Häufigkeit von Hydroxylgruppen auf jedem Monosaccharid. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um Glykopeptide in der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) anzureichern, die mehr hydrophile Glykopeptide von den hydrophoben, nicht modifizierten Peptiden^{trennen können 5}. Die Phosphorylierung fügt den Phosphatanteil hinzu, der außer bei saurem pH-Wert negativ geladen ist. Aufgrund dieser Ladung können verschiedene Metallkationen, einschließlich Titan, verwendet werden, um Phosphopeptide anzuziehen und zu binden, während nicht phosphorylierte Spezies weggespült werden. Dies ist das Prinzip der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC). Weitere Erörterungen dieser und anderer Anreicherungsstrategien für Glykosylierung und Phosphorylierung finden sich in den letzten Reviews ^6,7.

Vergleichsweise große Mengen an Ausgangspeptidmaterial (0,5 mg oder mehr) werden aufgrund der geringen Stöchiometrie von PTMs an Peptiden häufig für Anreicherungsprotokolle benötigt. In Szenarien, in denen diese Probenmenge möglicherweise nicht leicht gewonnen werden kann, wie z. B. Tumorkernbiopsie oder Liquoranalysen, ist es vorteilhaft, einfache Arbeitsabläufe zu verwenden, die zu maximalen biomolekularen Informationen führen. Jüngste Strategien, die von unserem Labor und anderen entwickelt wurden, haben die gleichzeitige und parallele Analyse von Glykosylierung und Phosphorylierung unter Verwendung desselben PTM-Anreicherungsworkflows 8,9,10,11,12 hervorgehoben. Obwohl sich die chemischen Eigenschaften dieser beiden PTMs unterscheiden können, können diese PTMs aufgrund der innovativen Trenntechniken und verwendeten Materialien in mehreren Schritten analysiert werden. Zum Beispiel überlagert die elektrostatische Abstoßungs-hydrophile Wechselwirkungschromatographie (ERLIC) Trennungen basierend auf hydrophilen Wechselwirkungen zwischen Analyten und der mobilen Phase mit Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen zwischen Analyten und dem stationären Phasenmaterial^13,14,15,16. Bei saurem pH-Wert kann die Anziehung phosphorylierter Peptide in die stationäre Phase ihre Retention und Trennung von nicht modifizierten Peptiden verbessern. Material, das aus Ti(IV) besteht, das auf hydrophilen Mikrosphären immobilisiert ist, kann für HILIC- und IMAC-basierte Elution verwendet werden, um Phosphopeptide und neutrale, saure und Mannose-6-phosphorylierte Glykopeptide^17,18 zu trennen. Diese Strategie wird als dual-funktionales Ti(IV)-IMAC bezeichnet. Die Verwendung dieser Strategien zur Anreicherung mehrerer PTMs in einem einzigen Workflow kann Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Interaktionen zugänglicher machen. Darüber hinaus sind die Gesamtprobenmenge und der Zeitaufwand geringer als bei den herkömmlichen Anreicherungsmethoden, wenn sie parallel durchgeführt werden (d. h. HILIC und IMAC auf separaten Probenaliquoten).

Um die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie für die gleichzeitige Analyse von Proteinglykosylierung und Phosphorylierung zu demonstrieren, haben wir sie zur Analyse von postmortalem menschlichem Pankreasgewebe angewendet. Die Bauchspeicheldrüse produziert sowohl Verdauungsenzyme als auch regulatorische Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon. Die Pankreasfunktion ist bei Bauchspeicheldrüsenerkrankungen beeinträchtigt. Bei Diabetes ist die Regulierung des Blutzuckers betroffen, was zu höheren Glukosespiegeln im Blut führt. Bei Pankreatitis resultiert eine Entzündung aus der Autoverdauung des^{Organs 3}. Veränderungen der PTM-Profile, einschließlich Glykosylierung und Phosphorylierung, können, wie es oft der Fall ist, bei anderen Krankheiten auftreten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Spin-Tip-basierte simultane Anreicherungsmethode, basierend auf einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Strategie, für N-Glykopeptide und Phosphopeptide, die aus Proteinen gewonnen werden, die aus Pankreasgewebe extrahiert werden. Das Protokoll umfasst Proteinextraktion und -verdauung, Anreicherung, MS-Datenerfassung und Datenverarbeitung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Daten aus dieser Studie sind über das ProteomeXchange-Konsortium mit der Kennung PXD033065 verfügbar.

Abbildung 1: Workflow zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus humanem Pankreasgewebe. Gewebe werden zunächst vor der Proteinextraktion mit dem Waschmittel Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einem feinen Pulver pulverisiert. Proteine werden dann einer enzymatischen Verdauung unterzogen. Die resultierenden Peptide werden vor der Anreicherung mit dual-funktionellem Ti(IV)-IMAC aliquotiert. Die Rohdaten werden mittels nanoskaliger Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS) gesammelt und mit Hilfe einer Datenbanksuchsoftware analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Protokoll soll PTM-Analysen zugänglicher machen und eine umfassendere Analyse mehrerer PTMs im selben Workflow ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf andere komplexe biologische Matrizen, einschließlich Zellen und Bioflüssigkeiten, angewendet werden.