Une stratégie d’enrichissement spin-tip pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains

Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) jouent un rôle majeur dans la modulation des structures protéiques et, par conséquent, de leurs fonctions et des processus biologiques en aval. La diversité du protéome humain augmente de façon exponentielle en raison de la variabilité combinatoire offerte par divers PTM. Différentes variantes de protéines de leurs séquences canoniques prédites par le génome sont connues sous le nom de protéoformes, et de nombreux protéoformes proviennent de PTM¹. L’étude de la diversité protéiforme en matière de santé et de maladie est devenue un domaine de recherche d’un grand intérêt ces dernières années ^2,3.

L’étude des protéoformes et plus particulièrement des PTM à grande profondeur est devenue plus facile grâce au développement de méthodes protéomiques basées sur la spectrométrie de masse (SEP). En utilisant la SEP, les analytes sont ionisés, fragmentés et identifiés en fonction du m/z des fragments. Les méthodes d’enrichissement sont souvent nécessaires en raison de la faible abondance relative des PTM par rapport aux formes non modifiées de protéines. Bien que l’analyse des protéines intactes et de leurs PTM, appelées analyses descendantes, soit devenue plus courante, la digestion enzymatique des protéines et l’analyse de leurs peptides constitutifs dans les analyses ascendantes restent la voie la plus largement utilisée pour l’analyse PTM. Les deux PTM les plus étudiés, et les deux PTM les plus courants in vivo, sont la glycosylation et la phosphorylation⁴. Ces deux PTM jouent un rôle majeur dans la signalisation et la reconnaissance cellulaires et sont donc des modifications importantes à caractériser dans la recherche sur les maladies.

Les propriétés chimiques de divers PTM fournissent souvent des voies vers l’enrichissement de ces PTM aux niveaux de protéines et de peptides avant l’analyse. La glycosylation est un PTM hydrophile en raison de l’abondance des groupes hydroxyles sur chaque monosaccharide. Cette propriété peut être utilisée pour enrichir les glycopeptides en chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC), qui peut séparer davantage de glycopeptides hydrophiles des peptides hydrophobes non modifiés⁵. La phosphorylation ajoute la fraction phosphate, qui est chargée négativement sauf à pH acide. En raison de cette charge, divers cations métalliques, y compris le titane, peuvent être utilisés pour attirer et lier les phosphopeptides tandis que les espèces non phosphorylées sont emportées. C’est le principe de la chromatographie d’affinité des métaux immobilisés (IMAC). D’autres discussions sur ces stratégies et d’autres stratégies d’enrichissement pour la glycosylation et la phosphorylation peuvent être trouvées dans des revues récentes ^6,7.

Des quantités relativement importantes de matériel peptidique de départ (0,5 mg ou plus) sont souvent nécessaires pour les protocoles d’enrichissement en raison de la faible stœchiométrie des PTM sur les peptides. Dans les scénarios où cette quantité d’échantillon peut ne pas être facilement obtenue, comme la biopsie du noyau tumoral ou les analyses du liquide céphalo-rachidien, il est avantageux d’utiliser des flux de travail faciles qui aboutissent à un maximum d’informations biomoléculaires. Les stratégies récentes développées par notre laboratoire et d’autres ont mis en évidence l’analyse simultanée et parallèle de la glycosylation et de la phosphorylation en utilisant le même flux de travail ^{d’enrichissement} PTM ^8,9,10,11,12. Bien que les propriétés chimiques de ces deux PTM puissent différer, ces PTM peuvent être analysés en plusieurs étapes en raison des techniques de séparation innovantes et des matériaux utilisés. Par exemple, la chromatographie d’interaction électrostatique répulsion-hydrophile (ERLIC) superpose des séparations basées sur les interactions hydrophiles entre les analytes et la phase mobile avec des interactions charge-charge entre les analytes et le matériau de phase stationnaire 13,14,15,16. À pH acide, l’attraction des peptides phosphorylés vers la phase stationnaire peut améliorer leur rétention et leur séparation des peptides non modifiés. Le matériau constitué de Ti(IV) immobilisé sur des microsphères hydrophiles peut être utilisé pour l’élution HILIC et IMAC afin de séparer les phosphopeptides et les glycopeptides neutres, acides et mannose-6-phosphorylés^17,18. Cette stratégie est connue sous le nom de Ti(IV)-IMAC à double fonction. L’utilisation de ces stratégies pour enrichir plusieurs PTM dans un seul flux de travail peut rendre les analyses des interactions de diaphonie PTM potentielles plus accessibles. De plus, la quantité totale d’échantillon et les exigences en temps sont inférieures aux méthodes d’enrichissement conventionnelles lorsqu’elles sont effectuées en parallèle (c.-à-d. HILIC et IMAC sur des aliquotes d’échantillon distinctes).

Pour démontrer la stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction pour l’analyse simultanée de la glycosylation et de la phosphorylation des protéines, nous l’avons appliquée pour analyser les tissus pancréatiques humains post-mortem. Le pancréas produit à la fois des enzymes digestives et des hormones régulatrices, y compris l’insuline et le glucagon. La fonction pancréatique est altérée dans la maladie pancréatique. Dans le diabète, la régulation de la glycémie est affectée, conduisant à des niveaux plus élevés de glucose dans le sang. Dans la pancréatite, l’inflammation résulte de l’auto-digestion de l’organe³. Des changements dans les profils PTM, y compris la glycosylation et la phosphorylation, peuvent entraîner, comme c’est souvent le cas, d’autres maladies.

Nous décrivons ici un protocole pour une méthode d’enrichissement simultané basée sur la pointe de spin, basée sur une stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction, pour les N-glycopeptides et les phosphopeptides dérivés de protéines extraites du tissu pancréatique. Le protocole comprend l’extraction et la digestion des protéines, l’enrichissement, la collecte de données sur la SEP et le traitement des données, comme le montre la figure 1. Les données représentatives de cette étude sont disponibles via ProteomeXchange Consortium avec l’identifiant PXD033065.

Figure 1 : Flux de travail pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains. Les tissus sont d’abord cryo-pulvérisés en une fine poudre avant l’extraction des protéines à l’aide du détergent dodécylsulfate de sodium (SDS). Les protéines sont ensuite soumises à une digestion enzymatique. Les peptides résultants sont alicités avant l’enrichissement à l’aide de Ti(IV)-IMAC à double fonction. Les données brutes sont collectées à l’aide de la chromatographie liquide en phase inversée à l’échelle nanométrique-spectrométrie de masse (nRPLC-MS) et sont analysées à l’aide d’un logiciel de recherche dans une base de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce protocole est destiné à rendre les analyses PTM plus accessibles et à permettre une analyse plus étendue de plusieurs PTM dans le même flux de travail. Ce protocole peut être appliqué à d’autres matrices biologiques complexes, y compris les cellules et les biofluides.