Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels
Summary
Posttranslationele modificaties (PTM’s) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.
Abstract
Massaspectrometrie kan een diepe dekking bieden van posttranslationele modificaties (PTM’s), hoewel verrijking van deze modificaties uit complexe biologische matrices vaak noodzakelijk is vanwege hun lage stoichiometrie in vergelijking met niet-gemodificeerde analyten. De meeste verrijkingsworkflows van PTM’s op peptiden in bottom-up proteomics-workflows, waarbij eiwitten enzymatisch worden verteerd voordat de resulterende peptiden worden geanalyseerd, verrijken slechts één type modificatie. Het is echter het hele complement van PTM’s dat leidt tot biologische functies, en verrijking van een enkel type PTM kan een dergelijke kruisverwijzing van PTM’s missen. PTM-kruisverwijzing is waargenomen tussen eiwitglycosylering en fosforylering, de twee meest voorkomende PTM’s in menselijke eiwitten en ook de twee meest bestudeerde PTM’s met behulp van massaspectrometrieworkflows. Met behulp van de hierin beschreven simultane verrijkingsstrategie worden beide PTM’s verrijkt uit postmortaal menselijk pancreasweefsel, een complexe biologische matrix. Dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie wordt gebruikt om verschillende vormen van glycosylering en fosforylering tegelijkertijd in meerdere fracties te scheiden in een handige op spintip gebaseerde methode, waardoor downstream-analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties mogelijk zijn. Deze verrijkingsworkflow voor glyco- en fosfopeptiden kan worden toegepast op verschillende monstertypen om diepe profilering van meerdere PTM’s te bereiken en potentiële doelmoleculen voor toekomstige studies te identificeren.
Introduction
Eiwit posttranslationele modificaties (PTM’s) spelen een belangrijke rol bij het moduleren van eiwitstructuren en bijgevolg hun functies en downstream biologische processen. De diversiteit van het menselijke proteoom neemt exponentieel toe als gevolg van de combinatorische variabiliteit die wordt geboden door verschillende PTM’s. Verschillende varianten van eiwitten uit hun canonieke sequenties zoals voorspeld door het genoom staan bekend als proteoformen, en veel proteoformen komen voort uit PTM’s1. Het bestuderen van proteoforme diversiteit in gezondheid en ziekte is de afgelopen jaren een onderzoeksgebied van groot belang geworden 2,3.
De studie van proteoformen en meer specifiek PTM’s met grote diepgang is gemakkelijker geworden door de ontwikkeling van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics-methoden. Met behulp van MS worden analyten geïoniseerd, gefragmenteerd en geïdentificeerd op basis van de m/z van fragmenten. Verrijkingsmethoden zijn vaak nodig vanwege de lage relatieve abundantie van PTM’s in vergelijking met niet-gemodificeerde vormen van eiwitten. Hoewel de analyse van intacte eiwitten en hun PTM’s, top-down analyses genoemd, meer routine zijn geworden, is de enzymatische vertering van eiwitten en de analyse van hun componentpeptiden in bottom-up analyses nog steeds de meest gebruikte route voor PTM-analyse. De twee meest bestudeerde PTM’s, en de twee meest voorkomende PTM’s in vivo, zijn glycosylering en fosforylering4. Deze twee PTM’s spelen een belangrijke rol in celsignalering en -herkenning en zijn dus belangrijke wijzigingen om te karakteriseren in ziekteonderzoek.
De chemische eigenschappen van verschillende PTM’s bieden vaak routes naar verrijking van deze PTM’s op eiwit- en peptideniveaus voorafgaand aan de analyse. Glycosylering is een hydrofiele PTM vanwege de overvloed aan hydroxylgroepen op elke monosaccharide. Deze eigenschap kan worden gebruikt om glycopeptiden te verrijken in hydrofiele interactiechromatografie (HILIC), die meer hydrofiele glycopeptiden kan scheiden van de hydrofobe niet-gemodificeerde peptiden5. Fosforylering voegt het fosfaatgedeelte toe, dat negatief geladen is, behalve bij zure pH. Vanwege deze lading kunnen verschillende metaalkationen, waaronder titanium, worden gebruikt om fosfopeptiden aan te trekken en te binden, terwijl niet-gefosforyleerde soorten worden weggespoeld. Dit is het principe van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Verdere discussies over deze en andere verrijkingsstrategieën voor glycosylering en fosforylering zijn te vinden in recente beoordelingen 6,7.
Relatief grote hoeveelheden uitgangspeptidemateriaal (0,5 mg of meer) zijn vaak nodig voor verrijkingsprotocollen vanwege de lage stoichiometrie van PTM’s op peptiden. In scenario’s waarin deze hoeveelheid monster mogelijk niet gemakkelijk kan worden verkregen, zoals tumorkernbiopsie of cerebrospinale vloeistofanalyses, is het nuttig om gemakkelijke workflows te gebruiken die resulteren in maximale biomoleculaire informatie. Recente strategieën ontwikkeld door ons laboratorium en anderen hebben de gelijktijdige en parallelle analyse van glycosylering en fosforylering benadrukt met behulp van dezelfde PTM-verrijkingsworkflow 8,9,10,11,12. Hoewel de chemische eigenschappen van deze twee PTM’s kunnen verschillen, kunnen deze PTM’s in meerdere stappen worden geanalyseerd vanwege de innovatieve scheidingstechnieken en gebruikte materialen. Elektrostatische repulsie-hydrofiele interactiechromatografie (ERLIC) overlays bijvoorbeeld scheidingen op basis van hydrofiele interacties tussen analyten en de mobiele fase met lading-ladingsinteracties tussen analyten en het stationaire fasemateriaal 13,14,15,16. Bij zure pH kan de aantrekkingskracht van gefosforyleerde peptiden naar de stationaire fase hun retentie en scheiding van niet-gemodificeerde peptiden verbeteren. Materiaal bestaande uit Ti(IV) geïmmobiliseerd op hydrofiele microsferen kan worden gebruikt voor HILIC en IMAC-gebaseerde elutie om fosfopeptiden en neutrale, zure en mannose-6-gefosforyleerde glycopeptidente scheiden 17,18. Deze strategie staat bekend als dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Het gebruik van deze strategieën voor het verrijken van meerdere PTM’s in één workflow kan analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties toegankelijker maken. Bovendien zijn de totale hoeveelheid monster en tijdsvereisten minder dan de conventionele verrijkingsmethoden wanneer ze parallel worden uitgevoerd (d.w.z. HILIC en IMAC op afzonderlijke monsteraliquots).
Om de dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie voor gelijktijdige analyse van eiwitglycosylering en fosforylering te demonstreren, hebben we deze toegepast om postmortale menselijke pancreasweefsels te analyseren. De alvleesklier produceert zowel spijsverteringsenzymen als regulerende hormonen, waaronder insuline en glucagon. De pancreasfunctie is aangetast bij pancreasaandoeningen. Bij diabetes wordt de regulatie van de bloedsuikerspiegel beïnvloed, wat leidt tot hogere glucosespiegels in het bloed. Bij pancreatitis is een ontsteking het gevolg van autovertering van het orgaan3. Veranderingen in PTM-profielen, waaronder glycosylering en fosforylering, kunnen, zoals vaak het geval is, resulteren in andere ziekten.
Hier beschrijven we een protocol voor een op spin-tip gebaseerde gelijktijdige verrijkingsmethode, gebaseerd op een dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie, voor N-glycopeptiden en fosfopeptiden afgeleid van eiwitten geëxtraheerd uit pancreasweefsel. Het protocol omvat eiwitextractie en -vertering, verrijking, MS-gegevensverzameling en gegevensverwerking, zoals te zien is in figuur 1. Representatieve gegevens uit deze studie zijn beschikbaar via ProteomeXchange Consortium met identifier PXD033065.
Figuur 1: Workflow voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels. Weefsels worden eerst gecryopiseerd tot een fijn poeder voordat eiwit wordt geëxtraheerd met behulp van het wasmiddel natriumdodecylsulfaat (SDS). Eiwitten worden vervolgens onderworpen aan enzymatische spijsvertering. De resulterende peptiden worden gealiquoteerd voorafgaand aan verrijking met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Ruwe gegevens worden verzameld met behulp van nanoschaal omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS) en worden geanalyseerd met behulp van database zoeksoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit protocol is bedoeld om PTM-analyses toegankelijker te maken en een bredere analyse van meerdere PTM’s in dezelfde workflow mogelijk te maken. Dit protocol kan worden toegepast op andere complexe biologische matrices, waaronder cellen en biovloeistoffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dual-functionele Ti(IV)-IMAC strategie is nuttig voor de gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit hetzelfde monster in een enkele monstervoorbereidingsworkflow. Erlic-gebaseerde methoden hebben ook aangetoond dat ze gelijktijdige verrijking van PTM’s uitvoeren. Beide strategieën zijn eerder gebruikt voor diepe dekking in PTM-analyses 14,18. Door de dual Ti-methode aan te passen aan het verminderen van de incubatietijd van monsters door g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door subsidiefinanciering van de NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 en R21AG065728) en Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B en SRA-2016-168-S-B). De hier gepresenteerde gegevens werden ook gedeeltelijk verkregen door steun van een NIH / NCATS UL1TR002373-prijs via het University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. De Orbitrap-instrumenten werden gekocht met de steun van een NIH shared instrument grant (NIH-NCRR S10RR029531) en office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education aan de University of Wisconsin-Madison. We willen ook de genereuze steun erkennen van de Orgaan- en Weefseldonatieorganisatie van de Universiteit van Wisconsin die de menselijke alvleesklier voor onderzoek heeft geleverd en de hulp van Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett en Prof. Jon Odorico voor het verstrekken van de monsters aan ons laboratorium. Ons onderzoeksteam wil in het bijzonder de families bedanken die weefsels hebben gedoneerd voor deze studie. L.L. erkent NIH-subsidie S10OD025084, een Pancreas Cancer Pilot-beurs van het Carbone Cancer Center van de Universiteit van Wisconsin (233-AAI9632), evenals een Vilas Distinguished Achievement Professorship en het Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship met financiering door de Wisconsin Alumni Research Foundation en de University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 – 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
