Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi
Summary
İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.
Abstract
Lökosit-endotel etkileşimlerinin intravital görüntülemesi, canlı hayvanlarda immün aracılı hastalık hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Akut akciğer hasarı (ALI)/akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve diğer solunum patolojilerinin in vivo olarak incelenmesi, akciğerlerin sınırlı erişilebilirliği ve doğal hareket artefaktları nedeniyle zordur. Bununla birlikte, bu zorlukların üstesinden gelmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu protokol, deneysel bir ALI modelinde pulmoner mikrosirkülasyondaki gerçek zamanlı lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için intravital floresan mikroskopi için bir yöntemi açıklamaktadır. İn vivo akciğer görüntüleme sistemi ve 3 boyutlu baskılı intravital mikroskopi platformu, anestezi uygulanan fareyi sabitlemek ve akciğeri stabilize etmek ve kafa karıştırıcı akciğer hasarını en aza indirmek için kullanılır. Hazırlığı takiben, lökosit yapışması, lökosit haddeleme ve kılcal fonksiyonu incelemek için geniş alan floresan mikroskobu kullanılır. Burada sunulan protokol, enflamatuar akciğer hastalığının akut bir modelinde görüntülemeye odaklanırken, akciğerdeki diğer patolojik ve fizyolojik süreçleri incelemek için de uyarlanabilir.
Introduction
İntravital mikroskopi (IVM), çeşitli biyofiziksel süreçleri in vivo olarak görselleştirmek ve incelemek için yararlı bir görüntüleme aracıdır. Akciğer, kapalı konumu, dokusunun kırılgan doğası ve solunum ve kalp atışı 1,2 tarafından indüklenen hareket artefaktları nedeniyle in vivo olarak görüntülenmesi oldukça zordur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için pulmoner mikrosirkülasyonda lökosit-endotel etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için çeşitli intravital mikroskopi (IVM) kurulumları geliştirilmiştir. Bu tür yaklaşımlar, görüntüleme için akciğerin cerrahi olarak açığa çıkarılmasına ve stabilize edilmesine dayanır.
Hayvanlar tipik olarak cerrahi prosedürlerle akciğer IVM’si için hazırlanır. İlk olarak, hayvanlar entübe edilir ve havalandırılır, bu da torasik bir pencerenin cerrahi eksizyonuna ve daha sonra görüntüleme için akciğeri stabilize etmek için müdahalelere izin verir. Bir teknik, parankimin bir cam kapak kayması3’e yapıştırılmasını içerir; bu, görüntülenen dokuya önemli fiziksel travma riski taşıyan bir prosedürdür. Daha gelişmiş olanı, akciğeri cam bir pencere altında stabilize etmek için bir vakum sisteminin kullanılmasıdır4. Bu kurulum, geniş bir lokal alana yayılmış geri dönüşümlü bir vakum yoluyla akciğer yüzeyinin kapak kaymasına gevşek yapışmasını kolaylaştırır ve x, y ve z boyutlarında hareketi sınırlandırırken akciğeri genişletir4. Vakum, kurulumun görüntüleme alanını çevreleyen bir kanaldan eşit olarak uygulanır ve dokuyu görüntüleme sınıfı kapak kayması4’e bakan sığ bir konik bölgeye çeker. Bu görüntüleme penceresinden, akciğer mikrosirkülasyonu çeşitli optik görüntüleme yöntemleri kullanılarak incelenebilir.
Akciğer IVM, çok sayıda mikrodolaşım parametresinin kantitatif görüntülenmesini sağlar. Bunlar arasında lökosit iz hızı ve uzunluğu5, kırmızı kan hücresi akış hızı6 ve oksijenasyon7, tümör metastazları8, immün hücre alt popülasyonlarının ayrımı 9,10,11, mikropartiküllerin görselleştirilmesi 12, alveolar dinamikler 13,14, vasküler geçirgenlik 15 ve kılcal fonksiyon 16 gibi ölçümler bulunmaktadır. . Buradaki odak noktası lökosit alımı ve kılcal fonksiyondur. Pulmoner mikrosirkülasyonda lökosit alımının başlatılması, her ikisi de enflamatuar koşullar altında artmış olan lökositler ve endotel hücreleri arasındaki geçici yuvarlanma etkileşimlerini ve sıkı yapışkan etkileşimleri içerir16,17. Tipik olarak, haddeleme, operatör tarafından tanımlanan bir referans çizgisini geçen lökositlerin sayısı ile ölçülürken, adezyon endotel16 üzerinde hareketsiz olan lökositlerin sayısı ile ölçülür. Kılcal fonksiyon da enflamatuar durumlarda etkilenebilir ve sıklıkla perfüzyonun azalmasına neden olur. Bu, kırmızı kan hücresi deforme edilebilirliğinin azaltılması18 ve endotel hücreleri tarafından indüklenebilir NO sentazın alacalı ekspresyonu da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlanabilir ve patolojik şant19 ile sonuçlanır. Tipik olarak, perfüze edilmiş kılcal damarların alan başına toplam uzunluğu ölçülür ve fonksiyonel kılcal yoğunluk (FCD) olarak rapor edilir.
Akciğerlerde lökosit alımını gerçek zamanlı olarak incelemek, biyolojik hedeflerin floresan boyalar veya floresan etiketli antikorlarla etiketlenmesini gerektirir20. Alternatif olarak, lizozim M-yeşil floresan protein (LysM-GFP) fareleri gibi çeşitli transgenik fare suşları, nötrofiller21,22 gibi spesifik bağışıklık hücresi alt kümelerini görüntülemek için kullanılabilir. Floresan etiketli lökositler daha sonra geniş alan floresan mikroskopisi, konfokal mikroskopi veya multifoton mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Bu teknikler, belirli uyarma dalga boylarını kullanarak ve yayılan floresanı tespit ederken, aynı zamanda uyarma dalga boyunun algılanmasını bloke ederek kontrast elde eder ve böylece etiketli nesneyi vurgular.
Murin akciğerinde lökosit haddeleme, adezyon ve fonksiyonel kılcal yoğunluğun miktarının belirlenmesi ile ilgili mevcut araştırmalar öncelikle manuel video analizine dayanmaktadır. Bu, Fiji 6,23 gibi açık kaynaklı yazılımlar, CapImage12 gibi özel mülk yazılımlar veya ısmarlama görüntü işleme sistemleri 24 aracılığıyla mümkün olmaktadır. Tersine, çeşitli özel mülk yazılım platformları (örneğin, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph), burada daha önce bahsedilenlerin birçoğu da dahil olmak üzere çok çeşitli diğer fizyolojik parametrelerin otomatik olarak ölçülmesini sağlar 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Akciğer IVM kullanılarak akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) patolojisi ile ilgili önemli gözlemler yapılmıştır. ARDS, endotel ve epitel bariyerinin işlev bozukluğunun neden olduğu pulmoner ödem ve alveoler hasar dahil olmak üzere akciğerde bir dizi patofizyolojik süreç ile karakterizedir25. Bir murin modeli kullanılarak, sepsis kaynaklı ALI’nın akciğer ortamında immün hücre kaçakçılığında önemli zararlı değişikliklerle ilişkili olduğu bulunmuştur26. Sepsis kaynaklı ALI ile farelerin kılcal damarlarına alınan nötrofillerin mikrosirkülasyonu engellediği ve böylece ALI26’da hipoksiyi arttırdığı bulunmuştur. Ek olarak, IVM, ARDS27’nin başlangıcını takiben altta yatan onarım mekanizması hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır. Akciğer IVM, çeşitli obstrüktif akciğer hastalıklarındaki patofizyolojik değişiklikleri anlamada da değerli bir araç olmuştur. Örneğin, kistik fibroz (KF) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıklarda mukus transportunun görselleştirilmesi, mukoza klerensi için yeni ve mevcut tedavilerin incelenmesini kolaylaştırmıştır28. Bu koşullar altında lökosit kaçakçılığı daanaliz edilmiştir 17.
Bu protokol, geleneksel floresan mikroskobu kullanarak lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için başlangıçta Lamm ve ark.29 tarafından tanımlanan yaklaşımı genişletmektedir. Tarif edilen prosedürler, 16.5 cm x 12.7 cm metal taban, mikromanipülatör ve vakum görüntüleme penceresi içeren bir in vivo akciğer görüntüleme sistemi kullanmaktadır (Şekil 1). Sistem, vantilatör borusu ve ısıtma yastığı için güvenli bağlantı sağlamak üzere 20 cm x 23,5 cm 3D baskılı bir platforma (Ek Dosya 1) monte edilmiştir. Bu yöntem, murin pulmoner mikrosirkülasyonun in vivo olarak tekrarlanabilir ve ölçülebilir görüntülenmesini sağlar. Cerrahi preparatın önemli yönleri ve vakumla stabilize edilmiş akciğer görüntüleme sisteminin doğru kullanımı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Son olarak, değiştirilmiş lökosit haddeleme, lökosit yapışması ve inflamasyonla ilişkili kılcal perfüzyonun temsili görüntülemesini ve analizini sağlamak için deneysel bir ALI modeli kullanılmıştır. Bu protokolün kullanımı, akut hastalık durumları sırasında pulmoner mikrosirkülasyondaki patofizyolojik değişiklikler üzerine daha önemli araştırmaları kolaylaştırmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol, birkaç kritik adıma pratik ve dikkat gerektirir. İlk olarak, entübasyon ve cerrahiye başlamadan önce görüntüleme penceresini hazırlamak önemlidir. Görüntüleme penceresinin dış halkasını kaplamak, kapak camını uygulamak ve bir damla damıtılmış su ile emiş testi yapmak için minimum miktarda vakum gresi kullanın. Bunu önceden hazırlamak, aksi takdirde kurulum sırasında maruz kalan akciğerin kurumasını önleyecektir. Sıcak salin ile yıkamak mümkün olsa da, bunu y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu makalenin düzenlenmesi ve gözden geçirilmesinde önemli uzmanlık sağlayan Dr. Pina Colarusso’ya teşekkür eder.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
