Прижизненная широкополевая флуоресцентная микроскопия микроциркуляции легких при экспериментальном остром повреждении легких с использованием вакуум-стабилизированной системы визуализации

Прижизненная микроскопия (IVM) является полезным инструментом визуализации для визуализации и изучения различных биофизических процессов in vivo. Легкое очень сложно изобразить in vivo из-за его закрытого расположения, хрупкой природы его ткани и артефактов движения, вызванных дыханием и сердцебиением ^1,2. Различные установки прижизненной микроскопии (IVM) были разработаны для визуализации в режиме реального времени взаимодействий лейкоцитов и эндотелия в микроциркуляции легких для преодоления этих проблем. Такие подходы основаны на хирургическом обнажении и стабилизации легких для визуализации.

Животные обычно готовятся к IVM легких хирургическими процедурами. Во-первых, животных интубируют и вентилируют, что позволяет хирургическое иссечение грудного окна и последующие вмешательства для стабилизации легкого для визуализации. Один из методов включает в себя приклеивание паренхимы на стеклянную крышку³, процедуру, которая рискует значительной физической травмой изображенной ткани. Более продвинутым является использование вакуумной системы для стабилизации легких под стеклянным окном⁴. Эта установка облегчает свободное прилипание поверхности легкого к покровному листу через обратимый вакуум, распределенный по большой локальной области, и расширяет легкое, в то же время ограничивая движение в размерах x, y и z⁴. Вакуум применяется равномерно через канал, окружающий область визуализации установки, и втягивает ткань в неглубокую коническую область, обращенную к крышке⁴ класса визуализации. Через это смотровое окно микроциркуляция легких может быть изучена с использованием различных оптических методов визуализации.

IVM легких позволяет проводить количественную визуализацию множества микроциркуляторных параметров. К ним относятся такие измерения, как скорость и длина трека лейкоцитов⁵, скорость кровотока эритроцитов⁶ и оксигенация⁷, метастазы опухоли⁸, различие субпопуляций иммунных клеток ^9,10,11, визуализация микрочастиц¹², альвеолярная динамика^13,14, проницаемость сосудов¹⁵ и капиллярная функция¹⁶ . Основное внимание здесь уделяется рекрутированию лейкоцитов и функции капилляров. Начало рекрутирования лейкоцитов в легочной микроциркуляции включает в себя преходящие скользящие взаимодействия и твердые адгезивные взаимодействия между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, оба из которых увеличиваются в воспалительных состояниях^16,17. Как правило, прокатка количественно определяется количеством лейкоцитов, которые проходят определенную оператором контрольную линию, в то время как адгезия количественно определяется количеством лейкоцитов, которые неподвижны на эндотелии¹⁶. Капиллярная функция также может быть затронута в воспалительных состояниях, что часто приводит к снижению перфузии. Это можно объяснить несколькими факторами, включая снижение деформируемости эритроцитов¹⁸ и пеструю экспрессию индуцируемой NO-синтазы эндотелиальными клетками, что приводит к патологическому шунтированию¹⁹. Как правило, совокупная длина перфузированных капилляров на площадь измеряется и сообщается как функциональная плотность капилляров (FCD).

Изучение рекрутирования лейкоцитов в легких в режиме реального времени требует маркировки биологических мишеней флуоресцентными красителями или флуоресцентно-мечеными антителами²⁰. Альтернативно, различные трансгенные мышиные штаммы, такие как лизоцим M-зеленого флуоресцентного белка (LysM-GFP) мышей, могут быть использованы для изображения специфических подмножеств иммунных клеток, таких как нейтрофилы^21,22. Флуоресцентно меченые лейкоциты затем могут быть визуализированы с использованием широкоугольной флуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии или многофотонной микроскопии. Эти методы достигают контраста, используя определенные длины волн возбуждения и обнаруживая излучаемую флуоресценцию, одновременно блокируя обнаружение длины волны возбуждения, тем самым выделяя меченый объект.

Существующие исследования, касающиеся количественной оценки катания лейкоцитов, адгезии и функциональной плотности капилляров в легких мышей, опирались в основном на ручной видеоанализ. Это стало возможным благодаря программному обеспечению с открытым исходным кодом, такому как Fiji ^6,23, проприетарному программному обеспечению, такому как CapImage¹², или индивидуальным системам обработки изображений²⁴. И наоборот, различные проприетарные программные платформы (например, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) позволяют автоматически измерять широкий спектр других физиологических параметров, включая многие из ранее упомянутых здесь 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Важные наблюдения были сделаны относительно патологии острого повреждения легких (АЛИ) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) с использованием ЛВМ легких. ОРДС характеризуется множеством патофизиологических процессов в легких, включая отек легких и повреждение альвеоляров, вызванное дисфункцией эндотелия и эпителиального барьера²⁵. Используя мышиную модель, было обнаружено, что АЛИ, индуцированный сепсисом, связан со значительными пагубными изменениями в торговле иммунными клетками в легочной среде²⁶. Было обнаружено, что нейтрофилы, набранные в капилляры мышей с ALI, вызванным сепсисом, препятствуют микроциркуляции, тем самым увеличивая гипоксию в ALI²⁶. Кроме того, IVM был использован для получения информации о базовом механизме восстановления после начала ARDS²⁷. IVM легких также был ценным инструментом в понимании патофизиологических изменений при различных обструктивных заболеваниях легких. Например, визуализация транспорта слизи при таких заболеваниях, как муковисцидоз (МВ) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), облегчила изучение новых и существующих методов лечения клиренса слизи²⁸. Также проанализирован оборот лейкоцитов в этих условиях¹⁷.

Этот протокол расширяет подход, первоначально описанный Lamm et ^al.29 для изучения лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий с использованием обычной флуоресцентной микроскопии. В описанных процедурах используется система визуализации легких in vivo , которая включает в себя металлическую основу размером 16,5 см х 12,7 см, микроманипулятор и вакуумное окно визуализации (рисунок 1). Система смонтирована в 3D-печатной платформе размером 20 см х 23,5 см (дополнительный файл 1) для обеспечения надежного крепления для трубки вентилятора и грелки. Этот метод предлагает воспроизводимую и поддающуюся количественной оценке визуализацию микроциркуляции легких мышей in vivo. Подробно объясняются важные аспекты хирургической подготовки, а также правильное использование вакуумно-стабилизированной системы визуализации легких. Наконец, экспериментальная модель ALI используется для обеспечения репрезентативной визуализации и анализа измененного катания лейкоцитов, адгезии лейкоцитов и капиллярной перфузии, связанной с воспалением. Использование этого протокола должно способствовать дальнейшим важным исследованиям патофизиологических изменений в микроциркуляции легких во время острых болезненных состояний.