Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos ^1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para imagem.

Os animais são tipicamente preparados para o IVM pulmonar por procedimentos cirúrgicos. Primeiro, os animais são entubados e ventilados, o que permite a excisão cirúrgica de uma janela torácica e intervenções subsequentes para estabilizar o pulmão para imagem. Uma técnica envolve colar o parenchyma em uma tampa de vidro³, procedimento que corre o risco de trauma físico significativo no tecido imageado. Mais avançado é a utilização de um sistema de vácuo para estabilizar o pulmão sob uma janela de vidro⁴. Esta configuração facilita a adesão frouxa da superfície pulmonar ao deslizamento de cobertura através de um vácuo reversível espalhado sobre uma grande área local e expande o pulmão enquanto ainda limita o movimento nas dimensões x, y e z⁴. O vácuo é aplicado uniformemente através de um canal ao redor da área de imagem da configuração e puxa o tecido para uma região cônica rasa de frente para o deslizamento de grau de imagem⁴. Através desta janela de visualização, a microcirculação pulmonar pode ser estudada utilizando várias modalidades de imagem óptica.

O IVM pulmonar permite imagens quantitativas de uma infinidade de parâmetros microcirculatórios. Estes incluem medidas como velocidade da pista leucócito e comprimento⁵, velocidade de fluxo de glóbulos vermelhos⁶ e oxigenação⁷, metástases^{tumorais 8}, distinção de subpopulações de células imunes ^9,10,11, visualização de micropartículas¹², dinâmica alveolar^13,14, permeabilidade vascular¹⁵, e função capilar¹⁶ . O foco aqui é o recrutamento de leucócitos e a função capilar. O início do recrutamento de leucócitos na microcirculação pulmonar envolve interações rolantes transitórias e interações adesivas firmes entre leucócitos e células endoteliais, ambas aumentadas sob condições inflamatórias^16,17. Normalmente, a rolagem é quantificada pelo número de leucócitos que passam por uma linha de referência definida pelo operador, enquanto a adesão é quantificada pelo número de leucócitos que são imóveis no endotélio¹⁶. A função capilar também pode ser afetada em estados inflamatórios, muitas vezes resultando em diminuição da perfusão. Isso pode ser atribuído a vários fatores, incluindo uma redução da deformabilidade dos glóbulos vermelhos¹⁸ e expressão variegada de sinthase indutível por células endoteliais resultando em desvio patológico¹⁹. Normalmente, o comprimento agregado de capilares perfusados por área é medido e relatado como densidade capilar funcional (FCD).

Estudar o recrutamento de leucócitos nos pulmões em tempo real requer rotular alvos biológicos com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes²⁰. Alternativamente, várias cepas de camundongos transgênicos, como camundongos lysozyme M-green fluorescente (LysM-GFP), podem ser utilizadas para imagem de subconjuntos de células imunes específicas, como os neutrófilos^21,22. Os leucócitos com rótulo fluorescente podem então ser visualizados usando microscopia de fluorescência widefield, microscopia confocal ou microscopia multifotífera. Essas técnicas conseguem o contraste utilizando comprimentos de onda de excitação específicos e detectando fluorescência emitida ao mesmo tempo em que bloqueiam simultaneamente a detecção do comprimento de onda de excitação, destacando assim o objeto rotulado.

Pesquisas existentes sobre a quantificação do rolamento de leucócitos, adesão e densidade capilar funcional no pulmão murino basearam-se principalmente na análise manual de vídeo. Isso é possível através de software de código aberto, como o Fiji ^6,23, software proprietário como o CapImage¹² ou sistemas de processamento de imagem^{personalizados 24}. Por outro lado, várias plataformas de software proprietárias (por exemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permitem a medição automatizada de uma ampla gama de outros parâmetros fisiológicos, incluindo muitos dos mencionados anteriormente aqui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Observações importantes têm sido feitas em relação à patologia da lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) utilizando IVM pulmonar. A ARDS é caracterizada por uma série de processos fisiodicosiológicos no pulmão, incluindo edema pulmonar e danos alveolares causados pela disfunção do endotélio e barreira epitelial²⁵. Usando um modelo murino, descobriu-se que a ALI induzida pela sepse está associada a mudanças prejudiciais significativas no tráfico de células imunes no ambiente pulmonar²⁶. Os neutrófilos recrutados para os capilares de camundongos com ALI induzido pela sepse foram encontrados para impedir a microcirculação, aumentando assim a hipóxia em ALI²⁶. Além disso, o IVM tem sido usado para obter insights sobre o mecanismo de reparo subjacente após o início do ARDS²⁷. O IVM pulmonar também tem sido uma ferramenta valiosa na compreensão de alterações fisiodicosiológicas em várias doenças pulmonares obstrutivas. Por exemplo, a visualização do transporte de mucosa em doenças como fibrose cística (CF) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) tem facilitado o estudo de tratamentos novos e existentes para a liberação de mucosas²⁸. O tráfico de leucócitos nessas condições também foi analisado, assim como¹⁷.

Este protocolo expande a abordagem inicialmente descrita por Lamm et ^al.29 para estudar interações leucócito-endotelial usando microscopia de fluorescência convencional. Os procedimentos descritos empregam um sistema de imagem pulmonar in vivo , que inclui uma base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulador e janela de imagem a vácuo (Figura 1). O sistema é montado em uma plataforma impressa 3D de 20 cm x 23,5 cm (Arquivo Suplementar 1) para fornecer fixação segura para o tubo do ventilador e almofada de aquecimento. Este método oferece imagens reprodutíveis e quantificáveis de microcirculação pulmonar murina em vivo. Aspectos importantes da preparação cirúrgica, bem como a utilização adequada de um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo são explicados em detalhes. Finalmente, um modelo experimental de ALI é usado para fornecer imagens representativas e análises de rolagem de leucócitos alterados, aderência leucócito e perfusão capilar associada à inflamação. O uso deste protocolo deve facilitar investigações mais importantes sobre alterações fisiofisiológicas na microcirculação pulmonar durante estados com doenças agudas.