מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) היא כלי הדמיה שימושי להדמיה וחקר של תהליכים ביופיזיים שונים in vivo. הריאה מאתגרת מאוד לצילום in vivo בשל מיקומה הסגור, האופי השברירי של הרקמה שלה וממצאי תנועה המושרים על ידי נשימה ודופק ^1,2. תצורות מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) שונות פותחו להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-סירקולציה ריאתית כדי להתגבר על אתגרים אלה. גישות כאלה מבוססות על חשיפה כירורגית וייצוב של הריאה לצורך הדמיה.

בעלי חיים מוכנים בדרך כלל להפריה חוץ גופית של הריאות בהליכים כירורגיים. ראשית, בעלי חיים הם intubated ומאוורר, אשר מאפשר כריתה כירורגית של חלון בית החזה והתערבויות לאחר מכן כדי לייצב את הריאה להדמיה. טכניקה אחת כוללת הדבקת הפרנצ’ימה על כיסוי זכוכית³, הליך המסתכן בטראומה פיזית משמעותית לרקמה המצולמת. מתקדם יותר הוא השימוש במערכת ואקום לייצוב הריאה מתחת לחלון זכוכית⁴. מערך זה מאפשר היצמדות רופפת של פני הריאה לכיסוי באמצעות ואקום הפיך המתפשט על פני שטח מקומי גדול ומרחיב את הריאה תוך הגבלת התנועה בממדים x, y ו-z⁴. הוואקום מוחל באופן שווה דרך תעלה המקיפה את אזור ההדמיה של המערך ומושך את הרקמה לאזור חרוטי רדוד הפונה לכיסוי ברמת הדמיה⁴. דרך חלון צפייה זה, ניתן לחקור את המיקרו-סירקולציה של הריאות באמצעות שיטות הדמיה אופטיות שונות.

Lung IVM מאפשר הדמיה כמותית של מספר רב של פרמטרים מיקרו-מעגליים. אלה כוללים מדידות כגון מהירות ואורך מסלול לויקוציטים⁵, מהירות זרימת תאי דם אדומים⁶ וחמצון⁷, גרורות גידול⁸, הבחנה בין תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון ^9,10,11, הדמיה של מיקרו-חלקיקים¹², דינמיקה של נאדיות^13,14, חדירות כלי דם¹⁵ ותפקוד נימי¹⁶ . ההתמקדות כאן היא בגיוס לויקוציטים ותפקוד נימי. התחלת גיוס לויקוציטים במיקרו-סירקולציה ריאתית כוללת אינטראקציות גלגול חולפות ואינטראקציות דבקות מוצקות בין לויקוציטים לתאי אנדותל, שניהם מוגברים בתנאים דלקתיים^16,17. בדרך כלל, גלגול הוא כימות על ידי מספר לויקוציטים העוברים קו ייחוס המוגדר על ידי מפעיל, בעוד הידבקות מכמתת על ידי מספר לויקוציטים שאינם תנועה על האנדותל¹⁶. תפקוד נימי עשוי להיות מושפע גם במצבים דלקתיים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך ירידה בזלוף. ניתן לייחס זאת למספר גורמים, כולל הפחתה של עיוות תאי דם אדומים¹⁸ וביטוי מגוון של NO synthase inducible על ידי תאי אנדותל וכתוצאה מכך shunting פתולוגי¹⁹. בדרך כלל, האורך המצטבר של נימים מחוררים לכל אזור נמדד ומדווח כצפיפות נימי תפקודית (FCD).

חקר גיוס לויקוציטים בריאות בזמן אמת דורש תיוג מטרות ביולוגיות בצבעים פלואורסצנטיים או בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית²⁰. לחלופין, ניתן להשתמש בזני עכברים מהונדסים שונים כגון lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) עכברים כדי לצלם תת-קבוצות ספציפיות של תאי מערכת החיסון כגון נויטרופילים^21,22. לאחר מכן ניתן לדמיין את הלויקוציטים בעלי התווית הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב, מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית מולטיפוטונים. טכניקות אלה משיגות ניגודיות על ידי שימוש באורכי גל ספציפיים של עירור וגילוי פלואורסצנציה הנפלטת תוך חסימת זיהוי אורך הגל של העירור, ובכך מדגישות את האובייקט המסומן.

מחקרים קיימים הנוגעים לכימות גלגול לויקוציטים, הידבקות וצפיפות נימים תפקודית בריאת מורין הסתמכו בעיקר על ניתוח וידאו ידני. זה מתאפשר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגון^{Fiji 6,23}, תוכנה קניינית כגון CapImage¹², או מערכות עיבוד תמונה מותאמות אישית²⁴. לעומת זאת, פלטפורמות תוכנה קנייניות שונות (למשל, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) מאפשרות מדידה אוטומטית של מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כולל רבים מאלה שהוזכרו כאן קודם לכן 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

נעשו תצפיות חשובות לגבי הפתולוגיה של פגיעה חריפה בריאה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות IVM ריאה. ARDS מאופיין בשורה של תהליכים פתופיזיולוגיים בריאה, כולל בצקת ריאות ונזק נאדי הנגרם על ידי תפקוד לקוי של מחסום האנדותל והאפיתל²⁵. באמצעות מודל מורין, נמצא כי ALI המושרה על ידי אלח דם קשור לשינויים מזיקים משמעותיים בסחר בתאי מערכת החיסון בסביבת הריאות²⁶. נויטרופילים שגויסו לנימים של עכברים עם ALI המושרה על ידי אלח דם נמצאו כמעכבים מיקרו-סירקולציה, ובכך מגבירים את ההיפוקסיה ב-ALI²⁶. בנוסף, IVM שימש כדי לקבל תובנות לגבי המנגנון הבסיסי של תיקון לאחר הופעת ARDS²⁷. Lung IVM היה גם כלי רב ערך בהבנת שינויים פתופיזיולוגיים במחלות ריאה חסימתיות שונות. לדוגמה, הדמיה של הובלת ריר במחלות כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) אפשרה את המחקר של טיפולים חדשניים וקיימים לפינוי ריריות²⁸. סחר בלוקוציטים בתנאים אלה נותח גם^{כן 17}.

פרוטוקול זה מרחיב את הגישה שתוארה לראשונה על ידי Lamm et ^al.29 לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. הפרוצדורות המתוארות משתמשות במערכת הדמיית ריאות in vivo, הכוללת בסיס מתכת בגודל 16.5 ס”מ על 12.7 ס”מ, מיקרומניפולטור וחלון הדמיית ואקום (איור 1). המערכת מותקנת על פלטפורמה מודפסת תלת-ממדית בגודל 20 ס”מ על 23.5 ס”מ (קובץ משלים 1) כדי לספק חיבור מאובטח לצינורות האוורור ולמשטח החימום. שיטה זו מציעה הדמיה ניתנת לשחזור ולכימות של מיקרו-סירקולציה ריאתית של מורין in vivo. היבטים חשובים של ההכנה הכירורגית, כמו גם ניצול נכון של מערכת הדמיית ריאות מיוצבת ואקום מוסברים בפירוט. לבסוף, מודל ניסיוני של ALI משמש כדי לספק הדמיה ייצוגית וניתוח של גלגול לויקוציטים שהשתנה, הידבקות לויקוציטים וזלוף נימי הקשור לדלקת. השימוש בפרוטוקול זה אמור להקל על חקירות חשובות נוספות של שינויים פתופיזיולוגיים במיקרו-סירקולציה ריאתית במהלך מצבי מחלה חריפים.