الفحص المجهري الفلوري واسع المجال داخل الحيوية لدوران الأوعية الدقيقة الرئوية في إصابات الرئة الحادة التجريبية باستخدام نظام تصوير مستقر بالفراغ
Summary
يمكن استخدام المجهر الفلوري داخل الحيوية لدراسة التفاعلات بين الكريات البيض والبطانية والتروية الشعرية في الوقت الفعلي. يصف هذا البروتوكول طرق تصوير هذه المعلمات وتحديدها كميا في دوران الأوعية الدقيقة الرئوي باستخدام نظام تصوير رئوي مستقر بالفراغ.
Abstract
يقدم التصوير داخل الحيوية للتفاعلات بين الكريات البيض والبطانية رؤى قيمة حول الأمراض المناعية في الحيوانات الحية. من الصعب دراسة إصابة الرئة الحادة (ALI) / متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) وغيرها من أمراض الجهاز التنفسي في الجسم الحي بسبب محدودية إمكانية الوصول والتحف المتحركة المتأصلة في الرئتين. ومع ذلك، فقد وضعت نهج مختلفة للتغلب على هذه التحديات. يصف هذا البروتوكول طريقة للفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية لدراسة التفاعلات البطانية الكريات البيض في الوقت الفعلي في دوران الأوعية الدقيقة الرئوية في نموذج تجريبي ل ALI. يتم استخدام نظام تصوير الرئة في الجسم الحي ومنصة الفحص المجهري داخل الحيوية المطبوعة 3-D لتأمين الماوس المخدر وتحقيق الاستقرار في الرئة مع تقليل إصابة الرئة المربكة. بعد التحضير ، يتم استخدام المجهر الفلوري واسع المجال لدراسة التصاق الكريات البيض ، وتدحرج الكريات البيض ، ووظيفة الشعيرات الدموية. في حين أن البروتوكول المعروض هنا يركز على التصوير في نموذج حاد لأمراض الرئة الالتهابية ، إلا أنه يمكن تكييفه أيضا لدراسة العمليات المرضية والفسيولوجية الأخرى في الرئة.
Introduction
المجهر داخل الحيوية (IVM) هو أداة تصوير مفيدة لتصور ودراسة العمليات الفيزيائية الحيوية المختلفة في الجسم الحي. الرئة صعبة للغاية للتصوير في الجسم الحي بسبب موقعها المغلق ، والطبيعة الهشة لأنسجتها ، والتحف المتحركة الناجمة عن التنفس وضربات القلب 1,2. تم تطوير العديد من إعدادات الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) للتصوير في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الكريات البيض والبطانية في دوران الأوعية الدقيقة الرئوية للتغلب على هذه التحديات. وتستند هذه الأساليب على كشف الرئة جراحيا وتثبيتها للتصوير.
عادة ما يتم إعداد الحيوانات ل IVM الرئة عن طريق العمليات الجراحية. أولا ، يتم تنبيب الحيوانات وتهويتها ، مما يسمح بالاستئصال الجراحي للنافذة الصدرية والتدخلات اللاحقة لتحقيق الاستقرار في الرئة للتصوير. تتضمن إحدى التقنيات لصق الحمة على غطاء زجاجي3 ، وهو إجراء يخاطر بصدمة جسدية كبيرة للأنسجة المصورة. الأكثر تقدما هو استخدام نظام فراغ لتحقيق الاستقرار في الرئة تحت نافذة زجاجية4. يسهل هذا الإعداد الالتصاق الفضفاض لسطح الرئة بالغطاء عبر فراغ قابل للعكس ينتشر على مساحة محلية كبيرة ويوسع الرئة مع الاستمرار في الحد من الحركة في أبعاد x و y و z4. يتم تطبيق الفراغ بالتساوي من خلال قناة تحيط بمنطقة التصوير في الإعداد ويسحب الأنسجة إلى منطقة مخروطية ضحلة تواجه الغطاء4 من فئة التصوير. من خلال نافذة العرض هذه ، يمكن دراسة دوران الأوعية الدقيقة في الرئة باستخدام طرق التصوير البصري المختلفة.
يتيح Lung IVM التصوير الكمي للعديد من معلمات الدورة الدموية الدقيقة. وتشمل هذه القياسات مثل سرعة مسار الكريات البيض وطولها5 ، وسرعة تدفق خلايا الدم الحمراء6 والأوكسجين7 ، ونقائل الورم8 ، والتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا المناعية9،10،11 ، وتصور الجسيمات الدقيقة12 ، وديناميات السنخية 13،14 ، ونفاذية الأوعية الدموية 15 ، ووظيفة الشعيرات الدموية 16 . ينصب التركيز هنا على تجنيد الكريات البيض ووظيفة الشعيرات الدموية. بدء تجنيد الكريات البيض في دوران الأوعية الدقيقة الرئوية ينطوي على تفاعلات المتداول العابرة والتفاعلات اللاصقة الثابتة بين الكريات البيض والخلايا البطانية ، وكلاهما يزداد في ظل الظروف الالتهابية16,17. عادة ، يتم تحديد كمية المتداول من خلال عدد الكريات البيض التي تمر عبر خط مرجعي محدد من قبل المشغل ، في حين يتم تحديد الالتصاق كميا بعدد الكريات البيض غير المتحركة على البطانة16. قد تتأثر وظيفة الشعيرات الدموية أيضا في الحالات الالتهابية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى انخفاض التروية. يمكن أن يعزى ذلك إلى عدة عوامل ، بما في ذلك الحد من تشوه خلايا الدم الحمراء18 والتعبير المتنوع عن NO synthase المستحث بواسطة الخلايا البطانية مما يؤدي إلى تحويل مرضي19. عادة ، يتم قياس الطول الكلي للشعيرات الدموية المنصهرة لكل منطقة والإبلاغ عنها ككثافة شعرية وظيفية (FCD).
تتطلب دراسة تجنيد الكريات البيض في الرئتين في الوقت الفعلي وضع علامات على الأهداف البيولوجية باستخدام أصباغ الفلورسنت أو الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت20. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام العديد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا مثل الفئران الفلورية الليزوزيم M-green (LysM-GFP) لتصوير مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية مثل العدلات21,22. يمكن بعد ذلك تصور الكريات البيض الموسومة بالفلورسنت باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال أو المجهر البؤري أو المجهر متعدد الفوتونات. تحقق هذه التقنيات التباين من خلال استخدام أطوال موجية محددة للإثارة واكتشاف التألق المنبعث مع منع اكتشاف الطول الموجي للإثارة في نفس الوقت ، وبالتالي تسليط الضوء على الجسم الموسوم.
اعتمدت الأبحاث الحالية المتعلقة بتحديد كمية الكريات البيض المتداول والالتصاق والكثافة الشعرية الوظيفية في رئة الفئران بشكل أساسي على تحليل الفيديو اليدوي. أصبح هذا ممكنا من خلال برامج مفتوحة المصدر مثل فيجي6،23 ، أو برامج احتكارية مثل CapImage12 ، أو أنظمة معالجة الصور المخصصة24. وعلى العكس من ذلك، تتيح العديد من منصات البرمجيات الاحتكارية (مثل NIS Element، وImaris، وVolocity، وMetaMorph) القياس الآلي لمجموعة واسعة من المعلمات الفسيولوجية الأخرى، بما في ذلك العديد من تلك المذكورة سابقا هنا5،6،7،8،9،10،11،12،13،15.
تم تقديم ملاحظات مهمة فيما يتعلق بأمراض إصابة الرئة الحادة (ALI) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) باستخدام IVM الرئة. يتميز ARDS بمجموعة من العمليات الفسيولوجية المرضية في الرئة ، بما في ذلك الوذمة الرئوية والضرر السنخي الناجم عن خلل في البطانة والحاجز الظهاري25. باستخدام نموذج الفئران ، وجد أن ALI الناجم عن الإنتان يرتبط بتغيرات ضارة كبيرة في الاتجار بالخلايا المناعية في بيئة الرئة26. تم العثور على العدلات التي تم تجنيدها في الشعيرات الدموية للفئران مع ALI الناجم عن الإنتان لإعاقة دوران الأوعية الدقيقة ، وبالتالي زيادة نقص الأكسجة في ALI26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام IVM للحصول على رؤى حول الآلية الأساسية للإصلاح بعد ظهور ARDS27. كان IVM الرئوي أيضا أداة قيمة في فهم التغيرات الفسيولوجية المرضية في مختلف أمراض الرئة الانسدادية. على سبيل المثال ، سهل تصور نقل المخاط في أمراض مثل التليف الكيسي (CF) ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) دراسة العلاجات الجديدة والحالية لإزالة المخاط28. كما تم تحليل الاتجار بالكريات البيض في ظل هذه الظروف وكذلك17.
يتوسع هذا البروتوكول في النهج الذي وصفه في البداية Lamm et al.29 لدراسة التفاعلات بين الكريات البيض والبطانيات باستخدام المجهر الفلوري التقليدي. تستخدم الإجراءات الموصوفة نظام تصوير الرئة في الجسم الحي ، والذي يتضمن قاعدة معدنية 16.5 سم × 12.7 سم ، ومناور دقيق ، ونافذة تصوير فراغية (الشكل 1). يتم تركيب النظام في منصة مطبوعة 3-D مقاس 20 سم × 23.5 سم (الملف التكميلي 1) لتوفير مرفق آمن لأنابيب التهوية ووسادة التدفئة. توفر هذه الطريقة تصويرا قابلا للتكرار وقابلا للقياس الكمي لدوران الأوعية الدقيقة الرئوية الفئرانية في الجسم الحي. يتم شرح الجوانب الهامة للتحضير الجراحي بالإضافة إلى الاستخدام السليم لنظام تصوير الرئة المستقر بالفراغ بالتفصيل. أخيرا ، يتم استخدام نموذج تجريبي من ALI لتوفير تصوير تمثيلي وتحليل لتغير الكريات البيض المتداولة ، والتصاق الكريات البيض ، والتروية الشعرية المرتبطة بالالتهاب. يجب أن يسهل استخدام هذا البروتوكول إجراء المزيد من التحقيقات المهمة في التغيرات الفسيولوجية المرضية في دوران الأوعية الدقيقة الرئوية أثناء حالات المرض الحاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب البروتوكول المعروض هنا الممارسة والاهتمام ببعض الخطوات الحاسمة. أولا ، من المهم إعداد نافذة التصوير قبل البدء في التنبيب والجراحة. استخدم الحد الأدنى من الشحوم الفراغية لتغطية الحلقة الخارجية لنافذة التصوير ، وتطبيق زجاج الغطاء ، واختبار الشفط بقطرة من الماء المقطر. إعداد هذا مقدم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة بينا كولاروسو ، التي قدمت خبرة كبيرة في تحرير وتنقيح هذه المخطوطة.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
