تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا
Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.
Abstract
يتم تقسيم تجمعات Ubiquinone (CoQ) في غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) جزئيا إلى إنزيمات معقدة I أو تعتمد على FAD. ويمكن تقييم هذا التقسيم الفرعي بسهولة عن طريق مقايسة مقارنة باستخدام NADH أو السكسينات كمتبرعين بالإلكترونات في الميتوكوندريا المذابة المجمدة، حيث يقاس انخفاض السيتوكروم ج (cyt c). يعتمد الفحص على تأثير Na+ على IMM ، مما يقلل من سيولته. هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس نشاط NADH-cyt c oxidoreductase وأنشطة أوكسيدوريدوكتاز خلية سكسينات c في وجود كلوريد الصوديوم أو KCl. يتم قياس التفاعلات ، التي تعتمد على خليط الكواشف في كوفيت بطريقة تدريجية ، الطيف الضوئي خلال 4 دقائق في وجود Na + أو K +. يتم تنفيذ نفس الخليط بالتوازي في وجود مثبطات الإنزيم المحددة من أجل طرح التغيير غير المحدد في الامتصاص. لا ينخفض نشاط NADH-cyt c oxidoreductase في وجود أي من هذه الكاتيونات. ومع ذلك ، ينخفض نشاط أوكسيدوريدوكتاز السكسينات – cyt c في وجود كلوريد الصوديوم. تسلط هذه التجربة البسيطة الضوء على: 1) تأثير Na+ في تقليل سيولة IMM ونقل CoQ ؛ 2) أن المركبين الفائقين I+III2 يحمي نقل يوبيكينون (CoQ) من التأثر بخفض سيولة IMM؛ 3) أن نقل CoQ بين CI و CIII يختلف وظيفيا عن نقل CoQ بين CII و CIII. تدعم هذه الحقائق وجود برك CoQ متباينة وظيفيا في IMM وتظهر أنه يمكن تنظيمها بواسطة بيئة Na+ المتغيرة للميتوكوندريا.
Introduction
نظام الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا (OXPHOS) هو المسار الرئيسي الذي يقود تخليق الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، واستهلاك المكافئات المختزلة ، مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) أو السكسينات ، بواسطة الميتوكوندريا. يتكون نظام OXPHOS من خمسة مجمعات بروتينية: المركب I (CI) يؤكسد NADH ويقلل من CoQ إلى يوبيكوينول (CoQH2). المركب الثاني (CII) يؤكسد السكسينات إلى فومارات ويقلل من CoQ إلى CoQH2. المركب الثالث (CIII) يؤكسد CoQH2 مرة أخرى إلى CoQ ، مما يقلل من السيتوكروم c (cyt c). أخيرا ، يؤكسد المركب IV (CIV) cyt c ويقلل من الأكسجين إلى الماء. تقترن سلسلة اختزال الأكسدة هذه ، ما يسمى بسلسلة نقل الإلكترون (mETC) ، بضخ H + عبر IMM ، مما يخلق تدرجا كهروكيميائيا يستخدمه المركب V (CV) إلى فوسفوريلات الأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) في ATP.
يمكن أن تكون مجمعات mETC إما بمفردها في IMM أو تتجمع في هياكل رباعية تسمى المجمعات الفائقة. يمكن أن تتجمع CIV مع CIII ، وتشكل III 2 + IV أو Q-respirasome (لأنها قادرة على التنفس في وجود CoQH 2) 1،2،3 أو تشكيل homodimers أو homooligomers4. يمكن أن يتفاعل CIII مع CI ، ويشكل التعقيد الفائق I + III25. أخيرا ، CI قادر أيضا على التفاعل مع Q-respirasome ، وبناء I + III2 + IV أو N-respirasome (حيث يمكنه التنفس استهلاك NADH) 1،6،7،8،9،10.
CoQ و cyt c هما حاملان إلكترونات متنقلان مسؤولان عن نقل الإلكترونات من CI / CII إلى CIII ، ومن CIII إلى CIV ، على التوالي. ما إذا كانت المجمعات العملاقة تفرض قيودا محلية وظيفية على هذه الناقلات أم لا كانت مسألة نقاش مكثف خلال العقدين الماضيين 2,7,11,12,13,14,15,16,17. ومع ذلك ، فقد أثبتت العديد من المجموعات المستقلة أنه يمكن تقسيم CoQ و cyt c وظيفيا إلى تجمعات في IMM. فيما يتعلق ب CoQ ، يمكن تقسيمه وظيفيا إلى تجمع CoQ محدد ل CI (CoQNAD) وتجمع آخر مخصص للإنزيمات المعتمدة على FAD (CoQFAD) 1،7،12،18،19. ومع ذلك ، من أجل التمييز بين وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا ، كان التعبير المفرط عن أوكسيديز البديل (AOX) وتوليد طفرات mtDNA محددة ، والتي يمكنها تجميع CI في غياب CIII ، مطلوبة1،19،20.
كانت آلية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء نقص الأكسجة غير معروفة حتى وقت قريب. عند نقص الأكسجة الحاد ، يخضع CI للانتقال النشط / النشط (A / D) ، والذي ينطوي على انخفاض في نشاط أوكسيدوريدوكتاز NADH-CoQ الذي يضخ H +. مثل هذا الانخفاض في ضخ H + يحمض مصفوفة الميتوكوندريا ويذيب جزئيا ترسب الكالسيوم والفوسفات في مصفوفة الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى إطلاق Ca2 + القابل للذوبان. هذه الزيادة في Ca 2+ القابلة للذوبان تنشط مبادل Na + / Ca2+ (NCLX) ، الذي يقذف Ca 2 + مقابل Na +. تتفاعل زيادة الميتوكوندريا Na+ مع الدهون الفوسفاتية في الجانب الداخلي من IMM ، مما يقلل من سيولتها ونقل CoQ بين CII و CIII ، وأخيرا ينتج أنيون فائق الأكسيد ، إشارة أكسدة وأكسدة21. ومن المثير للاهتمام أن نقل CoQ قد تضاءل فقط بين CII و CIII ، ولكن ليس بين CI و CIII ، مما يسلط الضوء على أن 1) Na+ كان قادرا على تعديل واحد فقط من تجمعات CoQ الموجودة في الميتوكوندريا. 2) توجد تجمعات CoQ متباينة وظيفيا في IMM. وبالتالي ، يمكن استخدام بروتوكول يستخدم على نطاق واسع لدراسة أنشطة إنزيم الميتوكوندريا لتقييم وجود تجمعات CoQ المذكورة.
يعتمد البروتوكول الحالي على قياس الحد من cyt c المؤكسدة ، ركيزة CIII ، عن طريق الامتصاص في وجود السكسينات (أي ركيزة CII) أو NADH (أي ركيزة CI). تنقسم نفس العينة إلى عينتين ، سيتم التعامل مع أحدهما باستخدام KCl ، والآخر بنفس تركيز كلوريد الصوديوم. وبهذه الطريقة ، بالنظر إلى أن Na + يقلل من سيولة IMM ، إذا كان CoQ موجودا في تجمع فريد في IMM ، فإن كل من CI + CIII و CII + CIII سينخفضان في وجود Na +. ومع ذلك ، إذا كان CoQ موجودا في تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا ، فإن تأثير Na + سيكون واضحا في الغالب (أو فقط) على نشاط CII + CIII ، ولكن ليس على CI + CIII. كما نشر مؤخرا21 ، يؤثر Na + فقط على نقل CoQ بين CII و CIII (الشكل 1C ، D) ، ولكن ليس بين CI و CIII (الشكل 1A ، B).
وقد استخدم هذا البروتوكول، إلى جانب مجموعة من التقنيات، لتأكيد وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا في IMM، واحدة مخصصة ل CI (أي CoQNAD)، وأخرى مخصصة للإنزيمات المرتبطة ب FAD (أي CoQFAD)1،3،7؛ ملاحظة أنه على الرغم من استمرار مناقشتها22 ، فقد تم تأكيدها بشكل مستقل من قبل العديد من المجموعات 7,19. وبالتالي ، فإن التجميع الفائق ل CI في مجمعات فائقة يؤثر على التنقل المحلي ل CoQ ، مما يسهل استخدامه من قبل CIII داخل المجمع الفائق1،7،13،14،23،24،25.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن هذا البروتوكول يمثل إجراء مباشرا للغاية لتحديد وجود تجمعات CoQ المجزأة جزئيا ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها. يفضل إضافة الركائز (أي NADH أو السكسينات) أخيرا نظرا لاحتمال حدوث الأكسدة الذاتية لهذه المركبات. يجب أن يكون تقليب كوفيت حذرا لتجنب تكوين فقاعات قد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مارتينيز – دي – مينا، و م. م. مونيوز – هيرنانديز، أ.، والدكتور س. خيمينيز و إ. ر. مارتينيز – خيمينيز على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل MICIN: RTI2018-099357-B-I00 و HFSP (RGP0016/2018). يتم دعم CNIC من قبل معهد Salud Carlos III (ISCIII) ، ووزارة العلوم ، و Innovación y Universidades (MCNU) ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (SEV-2015-0505). الشكل 2 تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
