На месте Гибридизация в сочетании с иммуногистохимией в криосекционированных эмбрионах рыбок данио-рерио

Рыбки данио-рерио являются мощной моделью позвоночных для изучения развития и генетики ^1,2. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию (70% генов являются общими с геномом человека), что позволяет использовать его в качестве модели для болезней человека³. У рыбок данио-рерио довольно часто обнаруживаются паттерны экспрессии двух генов и их пространственные отношения. Иммуногистохимия была впервые использована в 1941 году для обнаружения патогенов в инфицированных тканях путем применения антител, меченных FITC⁴. Белок-мишень в тканевом срезе сначала помечают первичным антителом, а затем срез помечают вторичным антителом против иммуноглобулина-хозяина первичного антитела. Окрашивание антител — это надежный подход к обнаружению локализации белков, который обеспечивает высокое оптическое разрешение на внутриклеточном уровне. Тем не менее, количество доступных антител очень ограничено у рыбок данио. Недавнее исследование показывает, что около 112 000 антител коммерчески доступны для мышей; Тем не менее, было продемонстрировано, что очень немногие антитела являются надежными у рыбок^{данио-рерио 5}.

Вместо этого у рыбок данио-рерио гибридизация in situ широко применяется для анализа паттернов экспрессии генов. Этот метод был впервые использован для оценки экспрессии генов у эмбрионов дрозофилы в 1980-х годах^6,7, и с тех пор эта технология постоянно развивалась и совершенствовалась. Первоначально для обнаружения транскриптов мРНК использовались ДНК-зонды с радиоактивной меткой; Однако пространственное разрешение было относительно низким, и существовали потенциальные риски для здоровья, вызванные радиоактивностью. Впоследствии гибридизация in situ опирается на РНК-зонды, меченные дигоксигенином (DIG) или флуоресцеином (Fluo), которые конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) или обнаруживаются с помощью флуоресцентного усиления тирамидного сигнала (TSA)^8,9. Несмотря на то, что TSA используется для обнаружения двух или трех генов, маркировка DIG РНК-зондов и антиDIG-конъюгированные антитела AP по-прежнему являются высокочувствительными, стабильными и широко используемыми подходами для гибридизации in situ. Таким образом, коммерциализированные антитела в сочетании с DIG-меченными зондами in situ полезны для понимания локализации белка и экспрессии одного гена.

Цельные эмбрионы не могут выявить пространственную связь между генами из-за низкого оптического разрешения, даже несмотря на то, что эмбрионы рыбок данио-рерио маленькие и прозрачные¹⁰. Следовательно, секционирование необходимо для анализа паттернов экспрессии генов на внутриклеточном уровне. Криосекция широко используется у рыбок данио, поскольку она проста в выполнении и может эффективно сохранять антиген. Таким образом, гибридизация in situ в сочетании с иммуногистохимией в криосекциях рыбок данио-рерио предлагает мощный способ анализа паттернов экспрессии двух генов. Комбинация гибридизации in situ и иммуногистохимии была применена к рыбкам данио-рерио¹¹. Однако лечение протеиназой К использовалось для усиления проникновения зонда за счет целостности антигена. Чтобы преодолеть это ограничение, этот протокол использует нагревание, чтобы вызвать извлечение антигена. Этот протокол применим не только к эмбрионам разных стадий и срезам тканей различной толщины (срезы головы 14 мкм и срезы спинного мозга 20 мкм), но также был проверен с использованием генов, экспрессируемых в двух органах, включая головной и спинной мозг.

В этой статье будет описано, как сочетать гибридизацию in situ и окрашивание антител у эмбрионов рыбок данио-рерио в криосекциях. Универсальность этого протокола демонстрируется с помощью ряда комбинаций гибридизации и иммуногистохимии in situ, включая зонды гибридизации in situ для двух разных нейронов. Этот метод подходит для обнаружения мРНК и белка в разных регионах и эмбрионах разного возраста, а также паттернов экспрессии двух генов.