Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati
Summary
Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l’ibridazione in situ e l’immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L’ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c’è una scarsità di anticorpi.
Abstract
Come vertebrato, il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato negli studi biologici. Il pesce zebra e gli esseri umani condividono un’elevata omologia genetica, che ne consente l’uso come modello per le malattie umane. Lo studio della funzione genica si basa sulla rilevazione dei modelli di espressione genica. Sebbene l’immunoistochimica offra un modo potente per saggiare l’espressione proteica, il numero limitato di anticorpi disponibili in commercio nel pesce zebra limita l’applicazione del costaining. L’ibridazione in situ è ampiamente utilizzata negli embrioni di zebrafish per rilevare l’espressione di mRNA. Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando ibridazione in situ e immunoistochimica per sezioni di embrioni di zebrafish. L’ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. L’immunoistochimica e l’imaging di una singola criosezione sono stati eseguiti dopo l’ibridazione in situ . Il protocollo è utile per svelare il modello di espressione di due geni, prima mediante il rilevamento di trascritti in situ e poi mediante immunoistochimica contro una proteina nella stessa sezione.
Introduction
Il pesce zebra è un potente modello di vertebrato per studi di sviluppo e genetica 1,2. Il pesce zebra e l’uomo condividono un’elevata omologia genetica (il 70% dei geni sono condivisi con il genoma umano), che ne consente l’uso come modello per le malattie umane3. Nel pesce zebra, è abbastanza comune rilevare i modelli di espressione di due geni e la loro relazione spaziale. L’immunoistochimica è stata utilizzata per la prima volta nel 1941 per rilevare agenti patogeni nei tessuti infetti applicando anticorpi marcati con FITC4. La proteina bersaglio nella sezione del tessuto viene prima marcata con un anticorpo primario e la sezione viene quindi etichettata con un anticorpo secondario contro l’immunoglobulina della specie ospite dell’anticorpo primario. La colorazione anticorpale è un approccio robusto per rilevare la localizzazione delle proteine, che offre un’elevata risoluzione ottica a livello intracellulare. Tuttavia, il numero di anticorpi disponibili è molto limitato nel pesce zebra. Uno studio recente mostra che circa 112.000 anticorpi sono disponibili in commercio per i topi; Tuttavia, pochissimi anticorpi si sono dimostrati affidabili nel pesce zebra5.
Invece, nel pesce zebra, l’ibridazione in situ è stata ampiamente applicata per l’analisi del pattern di espressione genica. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta per valutare l’espressione genica negli embrioni di Drosophila nel 19806,7, e da allora, questa tecnologia è stata continuamente sviluppata e migliorata. Inizialmente, sono state utilizzate sonde di DNA radiomarcate per rilevare trascritti di mRNA; Tuttavia, la risoluzione spaziale era relativamente bassa e c’erano potenziali rischi per la salute causati dalla radioattività. Successivamente, l’ibridazione in situ si basa sulle sonde di RNA marcate con digoxigenina (DIG) o fluoresceina (Fluo), che sono coniugate alla fosfatasi alcalina (AP) o rilevate mediante amplificazione del segnale fluorescente della tiramido (TSA)8,9. Sebbene la TSA sia stata utilizzata per rilevare due o tre geni, l’etichettatura DIG delle sonde di RNA e degli anticorpi antiDIG coniugati con AP sono ancora approcci altamente sensibili, stabili e ampiamente utilizzati per l’ibridazione in situ. Pertanto, gli anticorpi commercializzati combinati con sonde in situ marcate con DIG sono utili per fornire informazioni sulla localizzazione delle proteine e sull’espressione di un gene.
Gli embrioni interi non possono rivelare la relazione spaziale tra i geni a causa della bassa risoluzione ottica, anche se gli embrioni di zebrafish sono piccoli e trasparenti10. Quindi, il sezionamento è necessario per analizzare i modelli di espressione dei geni a livello intracellulare. La criosezione è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra in quanto è facile da eseguire e può preservare efficacemente l’antigene. Pertanto, l’ibridazione in situ combinata con l’immunoistochimica nelle criosezioni del pesce zebra offre un modo potente per analizzare i modelli di espressione di due geni. Una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica è stata applicata al pesce zebra11. Tuttavia, il trattamento con proteinasi K è stato utilizzato per migliorare la penetrazione della sonda a scapito dell’integrità dell’antigene. Per superare questa limitazione, questo protocollo utilizza il riscaldamento per indurre il recupero dell’antigene. Questo protocollo non è applicabile solo a embrioni di diversi stadi e sezioni di tessuto di vari spessori (sezioni della testa da 14 μm e sezioni del midollo spinale da 20 μm), ma è stato anche verificato utilizzando geni espressi in due organi, tra cui la testa e il midollo spinale.
Questo articolo descriverà come combinare l’ibridazione in situ e la colorazione anticorpale negli embrioni di zebrafish nelle criosezioni. La versatilità di questo protocollo è dimostrata utilizzando una serie di combinazioni di ibridazione in situ-immunoistochimica, comprese le sonde di ibridazione in situ per due diversi neuroni. Questo metodo è adatto per rilevare mRNA e proteine in diverse regioni ed embrioni di età diverse, nonché i modelli di espressione di due geni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo propone una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica, un passo importante negli esperimenti di colocalizzazione su embrioni di zebrafish. Questo metodo serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. L’ibridazione in situ e la colorazione anticorpale sono state eseguite su embrioni di zebrafish. In contrasto con diversi protocolli pubblicati in precedenza14,15,16,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e dalla Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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