広帯域刺激ラマン散乱顕微鏡に基づく多重化学イメージング

1. サンプル調製 注:このプロトコルは、化学的に不均一な混合物の濃度マップおよび特性SRSスペクトルの検索を記述する。 サンプルを調製するには、ポリメチルメタクリレート(PMMA)マイクロビーズの水性懸濁液から2 μLを抽出し( 材料表を参照)、2 μL画分を顕微鏡カバースリップに注ぎます。 清潔なピペットチップで、ポリスチレン(PS)マイクロビーズの水性懸濁液から2 μLを抽出し、それをカバースリップ上のPMMA懸濁液と組み合わせる。ピペットチップを使用して、懸濁液を静かに混合し、24時間乾燥させます。注:サンプル表面上のマイクロビーズの不釣り合いな量を避けるために、マイクロビーズ懸濁液の濃度を慎重に一致させることが重要です。PSビーズとPMMAビーズの直径は、それぞれ10μmと6μmです。これらの寸法は、SRSの生成効率を損なうことなく、顕微鏡の高い空間分解能を実証することを可能にする。 水が乾いたときに現れるビーズの平らな白い層の上に、20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)と20μLの純粋なオリーブオイルを加えます。 2番目の顕微鏡カバースリップの端にマニキュアを塗ります。マニキュアを下に向けてカバースリップを混合物の上に置き、密封するのに十分な圧力をかけます。乾かしましょう。注: 図 3 は、これらのステップで得られた例示的な結果を示しています。適切に密封されていれば、このサンプルは最大3ヶ月間持続するはずです。 2. ポンプとストークスビームの最適化 レーザーの電源を入れ、熱平衡に達します。GDD = -6,000 fs2 の負のグループ遅延分散(GDD)を基本ビームに適用します。メモ: この GDD 値は、OPO を正常に駆動するために重要であり、この設定に最適ですが、システムによって異なる可能性があります。負のGDDは、空間光変調器28に基づく格子対、プリズム圧縮機、またはパルス整形器を介して導入することができる。 偏光ビームスプリッター(PBS1)で基本レーザーを2つの分岐に分割します。狭帯域ストークスパルスを得るには、4Wの1つの分岐をエタロンに導きます。狭いスペクトル線が得られ、パルススペクトルのピークを中心とするまで、エタロンをわずかに回転させます( 図2の赤い曲線を参照)。注:このエタロンの有効フィネスは29で、自由スペクトル範囲は1,040nmで29.8nmです。 変調されたストークスパルスを得るには、狭帯域ビームを音響光学変調器に送ります。メモ: 図 4A に示すように、1 次回折ビームは 100% の変調を経験しますが、0 次は 50% しか発生しません。したがって、SRS信号を発生させずにサンプルの光損傷を誘発する可能性のある強力な非変調ビームでサンプルを照らすことを避けるために、1次を採用することが好ましい。 変調効率を最適化するには、レンズf1 とf2 の間の距離を変更します(図4B)。フォトダイオードで変調ビームを測定し、そのプロファイルをオシロスコープで記録します。 オシロスコープの読み取り値の振幅とベースラインの間に最大のコントラストが得られるまで、f1 とf2 の間の距離を変更します。注:このレンズのペアはコリメータとして動作しませんが、むしろAOMの結晶に効果的な焦点を作り出します。 第3レンズf3 を配置してストークスビームのウエストを微調整し、顕微鏡の焦点面での相互作用体積を変化させ、その結果、SRS信号を最適化する。メモ: ストークスビームは、このプロトコルでは 1.6 MHz で変調されました。 基本ビームの残りの6Wの光パワーを三ホウ酸リチウム(LBO)結晶(LBO 1、θ = 90°、φ = 13.8°)に集束させ、 第2高調波発生(SHG)によって基本ビームの周波数を2倍にします(図5A)。 SHG効率を最大化するには、水晶振動子をわずかに回転させ、φ角を変化させます(図5B)。LBO1 を最適化して、少なくとも 2.5 W の SHG を取得します。 LBO2 のφ角を調整して、信号ビームの生成効率を最大化します。注:レンズf1、f2、およびf3 の焦点距離は、SHGビームとOPOキャビティをモードマッチングするように慎重に選択されました。したがって、これらのレンズの焦点距離は、異なるセットアップで変化します。OPOキャビティ内の残留分散のために、キャビティの長さのわずかな変化は、信号ビームのスペクトルのシフトを誘発する。 キャビティの長さを調整して、1,040 nmの狭帯域ストークスとともに、1,373-5,090 cm-1以内の周波数デチューニングを生成できるポンプスペクトルを取得します。この範囲は、CH伸張スペクトル領域(2,800〜3,050cm−1)の振動をカバーする。 図 2 の青色スペクトルを参照してください。 励起顕微鏡の対物レンズによって誘起される分散効果を補償するには、広帯域ポンプをプリズムコンプレッサに送ります。ポンプをプリズムAの頂点からプリズムAに入力し、分散したポンプをプリズムBの頂点に導きます。必要な負の分散量を定義し、それに応じてプリズムの頂点L間の距離を設定します。注: 図6は 、プリズム29の配置を示す。この場合、補償はGDD≈-12,800 fs2に設定されました。したがって、L = 1.26 m。 ブリュースターカットのプリズムを使用してください。 ポンプビームの偏光がプリズムの三角形の平面(上/下の研磨されていない面)内にあることを確認します。 ポンプビームの入 射角θinがブリュースター角と一致することを確認します。 プリズムAの出口面がプリズムBの入射面と平行であることを確認します。 補償される広帯域パルスのGDDを推定するには、単一波長λ1のSRS信号を測定し、最大SRS(λ1)が得られるポンプストークス間の時間遅延τ1を記録する。 この手順を第2の波長λ2に対して繰り返し、SRS(λ2)が最大となる時間遅延τ2を再度登録する。 注:GDDは角周波数に対するグループ遅延の微分として定義されるため、前述の測定により、広帯域ビームのGDDの推定が可能になります(Eq [1])。(1) λ/2波長板を使用して、ポンプビームの偏光を45°に設定します。偏光ポンプを長さ13.3mmのYVO4 プレートに導き、この複屈折結晶の進相軸を垂直に設定します。注:YVO4 プレートを通過すると、ポンプパルスは2つの直交偏光レプリカに分割され、共線状に伝播しますが、それらの間に遅延Δt≈10psが維持されます。この遅延は、複屈折結晶の厚さと屈折率の関数である。以降、ストークスパルスと同じ分極状態のポンプレプリカを「信号」と呼び、直交状態のものを「基準」と呼ぶ。インライン平衡検出と呼ばれるこの技術の詳細は、以前に30で説明されている。 ポンプビームとストークスビームをダイクロイックミラーと組み合わせ、一対の蛍光ピンホールを使用して慎重に位置合わせし、両方がコリン状に伝播するようにします。ビームを減衰させ、レンズを使用して高速(少なくとも100MHzの帯域幅)フォトダイオードに集束させます。 ポンプをブロックし、高帯域幅のデジタルオシロスコープで単一のストークスパルスを測定します。レーザーのトリガ信号をオシロスコープの測定のクロックソースとして使用します。フォトダイオード電圧が最大に達する平均値を求めます。 ストークスビームをブロックし、ポンプパルスに対してこの手順を繰り返します。ポンプ(ストークス)ビームの光路を、そのパルスがストークス(ポンプ)パルスとほぼ同時に到着するまで増減します。メモ:これにより、2つのアーム間の光路差のマッチングにおいて、最大で数ミリメートルの精度が保証されます。 フォトダイオードを取り外し、ポンプストークス光子間の和周波数生成(SFG)に適したカット角度の非線形水晶を配置します。注:ここで使用した非線形結晶は、タイプI位相整合のために切断され、θ = 90°、φ = 9.8°であった。非線形結晶の光軸は、ストークスおよび信号パルスの偏光に平行でなければならない。 ポンプ/ストークスビームをわずかに非同一線にし、位相マッチングのためにポンプのSHGとストークスビームの間にある信号であるSFGまで遅延線を動かします。信号が見つからない場合は、水晶上の 2 つのビームの空間的な重なりを確認します。メモ: SFG は青色にシフトしており、肉眼で簡単に見えるはずです。 予期せぬ問題が発生した場合は、ローパスフィルターを配置してポンプとストークス、およびそれぞれのSHGを取り外し、分光計でSFGを測定します(図7A)。SFGが最大強度に達する時間遅延、つまり非線形信号生成に必要な理想的な時空間オーバーラップを決定する値を求め、そこに遅延線を固定します(図7B)。 校正されたカメラでビームプロファイルを測定します。または、赤外線カードを使用して、目で直径を推定します。ポンプ用とストークスビーム用の2つの望遠鏡を使用してください。これらの望遠鏡では、ビーム直径を励起対物レンズの背面開口部に合わせるようにしてください。メモ: この手順により、セットアップの最大空間分解能が保証されます。 SRS信号が得られたら、ポンプビームの望遠鏡を使用して直径を微調整し、レイリー範囲を変化させ、その結果、顕微鏡の焦点での相互作用体積を変化させます。最大SRSに達したら停止します。 フォトダイオードを使用してポンプ(ストークス)ビームの強度を測定し、フォトダイオードの応答性を使用して、検出器のアクティブ領域に衝突する平均電力 を計算します。 高帯域幅フォトダイオードを使用する場合は、電子ローパスフィルタを接続して、定数成分またはDC成分のみを取得します。δP(f)を測定するには、高帯域幅フォトダイオードの出力を接続し(ローパスフィルタを取り外します)、ロックインアンプの入力に接続します。ロックイン出力 を異なる復調周波数で保存し、フォトダイオードの応答性を使用してVからWに変換します。注:市販のロックインアンプには、δP(f)を測定するためのツールが内蔵されています(たとえば、チューリッヒインスツルメンツはLabOneに組み込まれています)。 ビームのRINを測定した後、レーザーをオフにして電子ノイズを測定します(つまり、検出器に光を当てずに計算されたRINです)。注:RINがショットノイズではなくレーザー変動によって制限されている場合、この暗い測定は測定に使用される計装の診断に役立ちます。電子ノイズがレーザーのRINと同じくらい高い場合、これを使用してレーザーのRINを測定することはできません。超低ノイズアンプは、電子ノイズを低減するために使用しなければならないかもしれません。 RINがレーザー変動ではなくショットノイズによって制限されている場合は、検出器により多くの光学パワーを当てます。 図 8 を参照してください。 3. SRSイメージング用のスペクトル検出の設定 ポンプとストークスビームを顕微鏡に導きます。 セクション 1 で説明したサンプルを配置し、ビーズのない領域を見つけて、ポンプ ビームの位置合わせに役立てます。カメラを使用して、ポンプ(ストークス)を遮断しながらストークス(ポンプ)ビームの反射プロファイルを測定します。顕微鏡の直前の鏡でレーザースポットの位置を調整します。メモ: 最高の SRS 世代を得るには、完全にオーバーラップする必要があります。 図9 は、(A)ポンプ、(B)ストークス、および(C)顕微鏡の焦点面において完全に重なった両方のビームを示す。 励起と収集の目的を混同する。注: 無限補正された対物レンズを使用すると、ポンプをサンプル平面に集束させると、収集目標の後方の開口部に平行ビームが生成されます。 ショートパスフィルターを入れて変調ストークスを取り除き、ポンプビームを格子に導きます。格子の後にレンズを配置して、分散ビームを検出器に集束させます。注:格子方程式は、線形分散(すなわち、所与の焦点距離f32のレンズを有する検出器平面におけるmm当たり何nm)を決定するのに役立つ。格子式は、格子の溝周期性d、入射角α、回折角β、回折波長λ、回折次数m(Eq[2])に関するものである。 (2) バランスの取れた検出のために、リファレンスのスペクトルとポンプビームに沿って伝播する信号レプリカを測定します。注:格子の後のポンプビームの空間プロファイルは、その長さに沿って広帯域ポンプの異なるスペクトル成分を含む線である。ポンプラインの各スペクトル成分は、球面レンズによって距離 f に集束されます(ステップ3.1〜3.2を参照)。 分散ポンプのクリッピングを避けるため、球面レンズを格子のできるだけ近くに置きます。球面レンズの直後にPBSを入れて、ポンプレプリカを分離します。注:ここでは、この種の偏光子がポンプビームの偏光をスクランブルしないため、偏光立方体ビームスプリッタを使用しました。また、異なるポンプレプリカを効果的に分離し、広帯域ポンプのクリッピングを回避するのに十分な大きさにすることができます。PBSは信号レプリカ(s偏波)を反射し、参照レプリカ(p偏波)を送信します。 一対のステアリングミラーを使用して、信号とリファレンスをそれぞれの検出器に誘導します(図1)。メモ: 理想的な平衡構成では、信号レプリカとリファレンスレプリカの光パワーは同じである必要があります。 ポンプビームのノイズを除去するには、信号を測定するフォトダイオードアレイのチャンネルをリファレンス検出器の対応するチャンネルと相関させます。したがって、信号および基準フォトダイオードアレイのn番目の フォトダイオードが、信号および参照レプリカの同じスペクトル成分の光パワーを測定するようにする。注: 図8は 、例示的なRINスペクトルを示す。 2つのフォトダイオードアレイ間のスペクトルマッチングを保証するには、格子とPBSの間に小さなスリットまたは虹彩を配置して、分散ポンプを空間的にフィルタリングします。ポンプレプリカの1つを除くすべてのスペクトル成分をクリップして、透過光線を基準および信号フォトダイオードアレイのn番目の 検出器に集中させます。前述のステアリングミラーを使用して、異なる検出チャンネルの相関関係を調整します。 この時点で、SRS顕微鏡検査を開始します。これを行うには、ストークスを変調し、サンプルをラスタースキャンし、ポンプスペクトル(ΔI)の変調転送を対応するDCスペクトル(I)とともに取得して、各ピクセルから正規化されたSRS(ΔI/I)スペクトルを取得します。行 (x) と列 (y) にサンプルのスキャン位置が含まれる 3 次元行列を生成します。x-y 平面に直交する各ベクトル (z) に、SRS スペクトルを格納します。メモ: 図 12 に、SRS ハイパースペクトル データの構造を示します。 ストークスビームの出力を65mW、広帯域ポンプビームの出力を20mWに設定します。実験の理想的な積分時間を設定します。注: ここでは、積分時間は 44 μs でした。しかし、ピクセルの滞留時間は、ピエゾスキャナが遅いために1ミリ秒でした。 4. ハイパースペクトルSRSデータのケモメトリックス 多変量曲線分解能解析を使用して、サンプルのさまざまな化学成分のもつれを解きます。Tauler, de Juan, and Jaumot33 のリンクから GUI をダウンロードしてください。注:ここでは、タウラーと同僚によって開発された多変量曲線分解能交互最小二乗法(MCR-ALS)MATLABプログラムが34,35個使用されました。MCR-ALSからSRSデータへの適用については、36,37を参照してください。アルゴリズムに関する詳細な議論については、38を参照してください。 MATLAB で、SRS ハイパースペクトル データ キューブを、SRS スペクトルを含む行を持つ行列 D に再形成します。展開されたSRLハイパーキューブDが、サンプルの化学成分の濃度CとスペクトルプロファイルSの線形結合であると仮定する(すなわち、D = CS T+ E、ここでEは実験誤差を含む行列であり、上付き文字Tは行列転置を示す)。 データの主要コンポーネントを取得して、 C と S を分離 します。セクション 1 で説明したサンプルに 4 つの種、つまり DMSO、オリーブ オイル、PMMA、および PS が含まれていることが先験的に知られているように、バックグラウンド ノイズを説明するために 4 つの種と別の種を検索するようにプログラムを構成します。種の数が多い、または少ない別のサンプルがある場合は、それに応じてプログラムを構成します。注: プログラムは、スペクトル データの特異値分解を行い、 純粋なスペクトル S の初期推測として使用します。 あるいは、既知のスペクトルトレース(例えば、物質の自発的なラマンスペクトル)を含むマトリックスをプログラムに供給する。注: 純粋なスペクトルの初期推定値を使用して、プログラムは C = DS(S TS)−1 および S T = (CT C)−1 C T D を計算します。 C と S の新しい値は、交互の最小二乗アルゴリズムで最適化されます。 SRS は負でない信号であるため、正の値だけを返すように交互の最小二乗アルゴリズムを制限します。注: 最適化された C と S により、新しい行列 D*= CST (プログラムが元のデータ D と比較するデータ セット) を構築できます。プログラムは、 D* と D の差が定義可能な任意のしきい値より小さくなるまで、これらのステップを自動的に反復処理します。 CとSをプロットして、サンプルの化学成分の化学画像と特性スペクトルを取得します。