הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לרכישת תמונות כימיות עם מיקרוסקופיית פיזור ראמאן (SRS) בפס רחב. בהתבסס על מיקרוסקופ SRS הפועל עם זיהוי דיפרנציאלי רב-ערוצי-נעילה, הפרוטוקול מתאר את הכנת הדגימה, התאמת מנגנון ה-SRS והכימומטריקה כדי לנטרל מרכיבים שונים של דגימות הטרוגניות מבחינה כימית.
Abstract
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקה אופטית לא ליניארית להדמיה כימית ללא תוויות. כלי אנליטי זה מספק מפות כימיות במהירות גבוהה, וברזולוציה מרחבית גבוהה של דגימות דקות על ידי חקירה ישירה של התנודות המולקולריות שלהן. ביישום הסטנדרטי שלה, מיקרוסקופיית SRS היא פס צר ויוצרת תמונות עם תדר רטט יחיד בלבד בכל פעם. עם זאת, גישה זו לא רק מעכבת את הספציפיות הכימית של SRS, אלא גם מזניחה את עושר המידע המקודד בספקטרום רטט.
ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי SRS בפס רחב, יישום המסוגל לחלץ ספקטרום רטט לכל פיקסל של התמונה במקביל. זה מספק נתונים היפרספקטרליים, שכאשר הם משולבים עם ניתוח כימומטרי, ממקסמים את כמות המידע שנשלף מהדגימה. לפיכך, פס רחב SRS משפר את הספציפיות הכימית של המערכת, ומאפשר את הקביעה הכמותית של ריכוז המרכיבים השונים של דגימה. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול להדמיה כימית עם מיקרוסקופ SRS בפס רחב, המבוסס על מיקרוסקופ SRS שנבנה בבית ופועל עם זיהוי מגבר נעילה רב-ערוצי דיפרנציאלי מותאם אישית. הוא דן בהכנת המדגם, יישור מנגנון SRS וניתוח כימומטרי. על ידי רכישת ספקטרום ראמאן רטטי, הפרוטוקול ממחיש כיצד לזהות מינים כימיים שונים בתוך תערובת, ולקבוע את הריכוזים היחסיים שלהם.
Introduction
מיקרוסקופיית ראמאן היא טכניקת הדמיה רבת עוצמה המספקת מפות כימיות עשירות על ידי מדידת פיזור ראמאן1, תהליך רדיאטיבי לא אלסטי שמקורו במולקולות הרוטטות בתגובה לאורתקרית 2,3. כל פיקסל של מפת ראמאן מכיל ספקטרום הנושא מידע ישיר על ההרכב הכימי והמבנה של הדגימה, וכתוצאה מכך תמונות עם ניגודיות רטט פנימית. נכון להיום, מיקרוסקופיית ראמאן היא נקודת הייחוס למחקרי מיקרוספקטרוסקופיה של תנודות מולקולריות, שכן אף טכניקת הדמיה אחרת אינה יכולה לייצר תמונות בעלות ספציפיות כימית גבוהה ורזולוציה מרחבית גבוהה4. למרות הספציפיות הכימית יוצאת הדופן שלו, יעילות הייצור של פיזור ראמאן נמוכה, מה שמחייב זמני השהייה ארוכים יותר של פיקסלים או עירור בהספק גבוה, מה שמוביל, בהתאמה, לשיעורי רכישה נמוכים ולאי-תאימות עם דגימות רגישות.
מחסור יחיד זה במיקרוסקופיית ראמאן הוביל חוקרים ליישם פיזור רמאן קוהרנטישל 5,6,7,8,9 כמקור ניגודיות למיקרוסקופיה. זהו תהליך אופטי לא ליניארי המגביר את התגובה הוויברציונית בכמה (עד שבעה) סדרי גודל, ובכך מאפשר הדמיה כימית במהירות גבוהה 10,11,12,13. בפרט, שתי טכניקות פיזור הראמן הקוהרנטיות הנפוצות ביותר הן פיזור רמאן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS)14 ופיזור ראמאן מגורה (SRS)15. בניגוד ל-CARS, SRS מראה תלות ליניארית בריכוז של מולקולות תהודה. הוא חסין מפני הרקע הלא-רסוננטי, אפקט לא ליניארי שאינו קשור לשום מעבר רטטי אך מעוות לצורות הלורנציאניות האופייניות לספקטרום ראמאן של התנודות המולקולריות16,17. לפיכך, מיקרוסקופיית SRS מניבה מידע ראמאן אותנטי המאפשר ניתוח תמונה כמותי ישיר.
SRS הוא תהליך אופטי מסדר שלישי, לא ליניארי, המספק מידע ישיר על הקשרים הכימיים של דגימה. מקורו בסופרפוזיציה הספטיוטמפוראלית של שני שדות אופטיים בדרך כלל באזור הספקטרלי הקרוב-אינפרה-אדום, כלומר המשאבה והסטוקס בתדר ωpu ו-ωS, בהתאמה 10,11,18. סופרפוזיציה זו יוצרת מכות בתדר המשאבה-סטוקס תוך ניתוק כוונון Ω = ωpu-ω S. כאשר Ω תואם רטט מולקולרי ΩR, המולקולה מהדהדת, וגורמת להעברת אנרגיה קוהרנטית בין שדות האור למולקולה. כתוצאה מכך, המולקולה מגיעה למצב של התרגשות רטט. ניתן לנטר תהליך זה על ידי מדידת השמדתם של פוטוני משאבה (אות המכונה אובדן ראמאן מגורה [SRL]) או הגברה מקבילה של פוטונים של סטוקס (תהליך המכונה רווח ראמאן מגורה [SRG]). SRG ו-SRL הם אותות קטנים (ΔI) שיושבים על גבי רקע אינטנסיבי ותנודתי (I). מכיוון שערכים טיפוסיים של אות ה-SRS (ΔI/I) נמצאים בטווח של 10-6-10-4, רעש הלייזר יכול בקלות לטשטש אותו. כדי למתן את ההשפעות המזיקות של רעש הלייזר על יחס האות לרעש (SNR) וכתוצאה מכך על מהירות ההדמיה, זיהוי SRS מסתמך על טכניקות העברת אפנון (למשל, מגברי נעילה, מעגלי תהודה או ממוצעים של מכוניות תיבה) בתדרי אפנון גבוהים (>1 מגה-הרץ), כאשר רעש הלייזר מגיע לערכיו המינימליים 15,19,20.
מיקרוסקופיית SRS קונבנציונלית משתמשת במשאבת פס צר (≈10 ס”מ−1) ובפולסים של סטוקס כדי להפיק תמונות כימיות בתדר רטט יחיד, ומאפשרת הדמיה בקצב וידאו עם זמני השהיית פיקסלים נמוכים עד ≈100 ns21,22. עם זאת, מכיוון שמיקרוסקופיית SRS בפס צר יוצרת מפות כימיות על ידי סריקה רציפה של הדגימה בתדרי רטט בודדים בלבד, המידע שלה מוגבלל-23. תמונות SRS עם ניגוד רטט אחד או שניים עשויות שלא להספיק כדי להבדיל בין מינים כימיים לבין רצועות ראמאן חופפות, במיוחד בתוך מערכות הטרוגניות. לכן, מיקרוסקופ SRS הצר הפרדיגמטי אינו מנצל את מלוא הפוטנציאל של SRS, מכיוון שחקירת קומץ תדרי רטט מעכבת את הספציפיות הכימית שלו ומזניחה את עושר המידע המקודד בספקטרום רטט. יתר על כן, סריקה רציפה של הדגימה בתדרים שונים גורמת לזמני השהייה ארוכים יותר של פיקסלים שיכולים להפעיל את ה-photodamage ולמנוע תזוזה מרחבית קפדנית בין תמונות עוקבות, מה שמוביל לממצאי תנועה.
בניגוד למקבילה שלה בפס צר, מיקרוסקופיית SRS בפס רחב מאחזרת ספקטרום רטט לפיקסל בכל סריקת דגימה 10,12,24. לפיכך, SRS בפס רחב מספק הדמיה היפרספקטרלית עם ליבה מרחבית קפדנית של ניגודים רטטיים שונים, ומאפשר ניתוח נתונים קפדני. זה לא רק חושף את המרכיבים הכימיים של הדגימה באמצעות ספקטרום ראמאן, אלא גם עוזר לקבוע את הריכוזים היחסיים שלהם. בהתאם לאופן שבו הספקטרום נרכש, מיקרוסקופיית SRS בפס רחב מסווגת כ- SRS היפרספקטרלי או מולטיפלקס SRS. ב-SRS היפרספקטרלי, ספקטרום ה-SRS לכל נקודה סרוקה של הדגימה נרכש ברצף (כלומר, הוא מוחזר על ידי טאטוא כוונון התדרים Ω), ובונה ספקטרום SRS על ידי ערימה של אותות ה-SRS בהזזות ראמאן עוקבות. ספקטרום הראמן נמדד בו זמנית במספר מצבי רטט במולטיפלקס SRS. לפיכך, גישת המולטיפלקס SRS משלבת פולס פס צר מאופנן עם פולס פס רחב כדי להניע את אות ה-SRS בתדרים שונים, ומשתמשת בגלאי רב-ערוצי עם רגישות דומה לזו של SRS בפס צר כדי לזהות את ספקטרום ה-SRS.
מאמר זה מציג פרוטוקול להפקת מפות כימיות של דגימות הטרוגניות באמצעות מיקרוסקופיית SRS מולטיפלקס. סכימה של מיקרוסקופ SRS המשמשת בפרוטוקול זה מתוארת באיור 1 ומתוארת בפירוט במקום אחר 25,26,27. בקצרה, לייזר סיבי Yb נעול במצב מסחרי, המפיק פולסים של 140 fs שבמרכזם 1040 ננומטר, עם הספק ממוצע של 10 ואט וקצב חזרות של 80 מגה-הרץ, מניע את מיקרוסקופ ה-SRS בפס רחב. מפצל קרן מקטב (PBS) מפריד את הקורה הבסיסית לשני ענפים. כדי לייצר את הפולסים של סטוקס בפס הצר, ענף אחד עם 4 W של הקרן הבסיסית נשלח לאטאלון שמייצר קרן פס צר (≈15 ס”מ-1), אשר מווסתת לאחר מכן ב-1.6 מגה-הרץ עם אפנן אופטי אקוסטי (AOM). החלק הנותר עם 6 W של הקרן הבסיסית מוכפל בתדר עם גביש ליתיום טריבוראט (LBO) בעובי 2.8 מ”מ, שנחתך להתאמת פאזה מסוג I (θ = 90°, φ = 13.8°). הדור ההרמוני השני שנוצר ב-520 ננומטר עובר לחלל מקופל X כדי לשאוב מתנד פרמטרי אופטי (OPO), התקן המשתמש בגביש LBO בעובי 3.0 מ”מ (התאמת פאזה מסוג I, θ = 90°, φ = 9.8°) כמדיום פעיל כדי לספק קרינה אופטית בפס רחב הניתנת לכוונון בתוך האזור הספקטרלי של 680-910 ננומטר (איור 2). פולסים אלה בפס רחב משמשים כמשאבה בניסויי SRS ומתפשטים למדחס מנסרה כדי לפצות מראש על השפעות הפיזור המושרות על ידי מטרת המיקרוסקופ.
לאחר שלב הדחיסה, לוחית גל λ/2, בשילוב עם לוחית דו-פרצופית YVO4 , מייצרת שני העתקים מקוטבים אורתוגונליים שהחיסור האלקטרוני שלהם במישור הגילוי מבטל את הרעש של משאבת הפס הרחב. מראה דיכרואית משלבת את המשאבה ואת קורות סטוקס ושולחת אותן למיקרוסקופ זקוף. מטרת טבילה במים עם מפתח צמצם מספרי (NA) של 1.27 ממקדת את האור על הדגימה, בעוד שמטרת טבילת שמן עם NA של 1.4 אוספת אותה. לפני שלב הגילוי, מסנן מעבר קצר (SPF) מסיר את הסטוקסים המאופננים, בעוד שסורג עקיפה הפועל בתצורת ליטרו מפזר את משאבת הפס הרחב המועברת. PBS2 שני מפריד בין העתקי המשאבה, ועדשה ממקדת אותם בשני מערכי פוטודיודה. האותות ממערכי פוטודיודה אלה מופחתים באופן אלקטרוני ונשלחים למגבר נעילה רב-ערוצי (M-LIA) שנבנה בבית. האות המופחת מנורמל לאחר מכן על ידי קריאות הזרם הישיר (DC) של אחד ממערכי הפוטודיודה, ובכך מייצר את ספקטרום ה-SRL.
כניסוי למופת, אנו מדמיינים תערובות של כמה מפזרי רמאן ידועים, שלכל אחד מהם ספקטרום רמאן ייחודי. לפיכך, הפרוטוקול מתחיל בתיאור כיצד להכין את דגימות הייחוס. כאשר אנו מזהים SRL, אנו ממשיכים להסביר כיצד להשיג פולסים של סטוקס בפס צר ולהגדיר את המקור האופטי המספק את פולסים של משאבת הפס הרחב (≈250 ס”מ-1), כלומר, OPO שנבנה בבית. הפרוטוקול מציג את היישור והאופטימיזציה של האלומות האופטיות, ומתאר פרמטרים קריטיים כגון העוצמה והספקטרום של סטוקס בפס הצר ומשאבת הפס הרחב. הפרוטוקול מתאר בפירוט את הנתיב האופטי של משאבת הפס הרחב מכיוון שהוא דורש אלמנטים אופטיים מיוחדים. זה גם מסביר כיצד למצוא את החפיפה המרחבית-טמפורלית בין פולסים של משאבה-סטוקס ומראה דרך מעשית לקבוע את רעש העוצמה היחסית (RIN), אשר בתורו עוזר להגדיר את תדירות המודולציה הטובה ביותר עבור ניסויי SRS. לאחר מכן, אנו מסבירים את עקרון העבודה והכיול של שרשרת האיתור. לבסוף, הפרוטוקול מציג את תהליך איסוף הנתונים, הכימומטריה וצינור עיבוד התמונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופיית SRS בפס רחב היא טכניקת הדמיה רבת עוצמה המציעה ניגודיות כימית אותנטית כדי לזהות ולפרק את המרכיבים הכימיים של דגימה הטרוגנית. הפוטנציאל של כלי אנליטי זה יכול להועיל למספר תחומי מחקר, החל ממדע החומרים ועד היסטופתולוגיה. החיסרון של מיקרוסקופיית SRS בפס רחב הוא העובדה שהיא תובענית מבחינה טכנית; הנסייניסט לא רק דורש ידע על מקורות לייזר בפס רחב, אלא גם צריך לתמרן את פולסי הלייזר כדי ליצור ביעילות SRS, אות שבתורו צריך להימדד באמצעות סכימות זיהוי מתוחכמות. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר זרימת עבודה להפקת מפות כימיות של תרכובות כימיות מעורבות באמצעות מיקרוסקופ SRS בפס רחב מרובה. למרות שהעבודה המתוארת עשויה להיות טריוויאלית עבור כמה פיזיקאים של לייזר ומיקרוסקופיסטים לא ליניאריים, ייתכן שזה לא המקרה עבור קוראים המעוניינים ביתרונות של מיקרוסקופיית SRS בפס רחב שהידע המדעי שלה שוכן מחוץ לתחומים אלה. לכן, שאפנו לפרט כל צעד כדי להנחות את הקהל הרחב המעוניין במיקרוסקופיית SRS בפס רחב.
הפרוטוקול שלפנינו התחיל בכך שהראה כיצד להכין דגימה פשוטה אך עשירה בספקטרוסקופית המורכבת מכמה מפזרי ראמאן חזקים ומוכרים. דנו כיצד להשיג את משאבת הפס הרחב ואת קורות סטוקס בפס הצר הדרושות להקמת מיקרוסקופ SRS. איור 5C מציג סכימה של הגדרות SHG ו-OPO. שימו לב שעדשה f1 ממקדת את הקרן הבסיסית על LBO1 כדי ליצור את ה-SHG, בעוד שמראה דיכרואית משקפת את קרינת ה-SHG ומעבירה את הקרן היסודית השיורית. עדשה שנייה f2 קולשת את קרן SHG. כאשר f2 > f1, קרן SHG מורחבת על ידי גורםהשווה ל- f 2/f1. עדשה שלישית f3 ממקדת את קרן SHG המורחבת בגביש LBO מסוג I שני (LBO2) שנחתך ב- θ = 90° ו- φ = 29.0°. על ידי שאיבת LBO2 עם ה-SGH (520 ננומטר) הנ”ל, הקרינה בטווח של 680-910 ננומטר תצא מ-LBO2 דרך יצירת תדרי הפרש (DFG), ותיצור שתי אלומות: האות והבטלן27 (איור 5D,E). האחרון מושלך בעוד הראשון מוגבר בחלל OPO כדי לספק את פולסים המשאבה המשמשים בניסויי SRS. אין לבלבל את המשאבה של OPO ב-520 ננומטר, כלומר את קרן SHG, עם המשאבה של ניסויי ה-SRS (כלומר, קרן האות של ה-OPO).
הניגודיות במיקרוסקופ SRS נובעת מאות לא ליניארי שנוצר בנקודת המוקד של המיקרוסקופ, אות הדורש רכזת מספר רב של פוטונים במישור הדגימה בזמן נתון. כליאה זו של פוטון מושגת עם מטרת מיקרוסקופ צמצם נומרי גבוה (NA), מערך עדשות שקובע גם את הרזולוציה המרחבית של המערכת: ככל שה-NA גבוה יותר, כך הרזולוציה המרחבית גבוהה יותר. עם זאת, מטרות NA גבוהות עמוסות בצפיפות בזכוכית, מה שמכניס GDD חיובי לקרינה פועמת, ציוץ תדר שבסופו של דבר מרחיב את הפרופיל הזמני של הפולסים39. לפיכך, ה-GDD שהוצג על ידי מטרת המיקרוסקופ עשוי להאריך את משך פולסים של משאבת הפס הרחב, מה שהופך אותו לארוך עוד יותר מהמעטפת הטמפורלית של סטוקס ומפחית את רוחב הפס האפקטיבי והנגיש של אות הרמאן. יתר על כן, הרחבה זו עשויה גם ליצור עיוות של הפרופיל הספקטרלי של ספקטרום ה-SRS הנמדד.
ב-CARS, האות הרלוונטי מבחינה ספקטרוסקופית מתגלה באורכי גל השונים מאלו של שדות העירור. ניתן להשתמש בצינור פוטומולטיפלייר פשוט יותר או במצלמת התקן מצומד לטעינה (CCD) כדי לשלב את אות ה-CARS בזמן, תוך סיכום אלפי פולסים כדי למדוד את רעש הלייזר הממוצע. במקום זאת, אות ה-SRS מופיע כהעברת אפנון קלושה המוטבעת בתוך רקע לייזר חזק ותנודתי. מכיוון שמודולציה זו חלשה, רעש הלייזר יכול להציף אותו בקלות, ולהפחית הן את מהירות ההדמיה והן את הרגישות של מיקרוסקופ SRS. לכן, לפני ההדמיה, חובה למדוד את רעש העוצמה היחסית (RIN) כדי לקבוע אם הלייזר מתאים להדמיית SRS במהירות גבוהה ולבחור את תדר המודולציה עם הרעש הנמוך ביותר. ה-RIN מוגדר כצפיפות הספקטרלית של הספק הרעש [δP(f), עם יחידות W2/Hz] של הלייזר המנורמלות על ידי ההספק האופטי הממוצע (
)40,41. במילים אחרות, ה-RIN מתאר את תנודות הלייזר המנורמלות בתדרים שונים (Eq [4]).
(4)
לפיכך, RIN הוא פרמטר של מערכת SRS הקובע את טווח תדרי האפנון האידיאלי עבור הניסויים. לדוגמה, חטיף הזית באיור 8 מראה את טווח תדרי המודולציה האידיאלי להדמיית SRS. במקרה של SRS בפס צר, המשתמש צריך למדוד את ה- RIN של המשאבה ושל סטוקס כדי לבחור איזו קרן צריכה להיות מווסתת כדי להשיג ביצועים אופטימליים. שימו לב מאיור 8, למשל, שלקרן סטוקס יש RIN מעט גבוה יותר מהמשאבה, מה שמרמז על כך שמדידות ה-SRG יתבררו רועשות יותר ממקבילותיהן ב-SRL. במקרה של SRS בפס רחב, הקרן שיש לאמוד היא קרן הפס הצר.
הפיזור הזוויתי D של הסורג מבטא את זווית הדיפרקציה כפונקציה של אורך הגל, ומוגדר כנגזרת של משוואת הסורגים. עבור תצורת ליטרו, הפיזור הזוויתי ניתן על ידי Eq (5).
(5)
כדי לקבל Eq (5), הנחנו α = β, פתרנו את Eq (2) עבור m/d והכנסנו את התוצאה לתוך dβ/ dλ. שימו לב שבתצורת ליטרוב, β = sin-1(mλ/2d). בתוך קירוב הזווית הקטנה, השינוי במיקום לאורך הספקטרום הוא fdβ ≈ dl (איור 10). לפיכך, על ידי הכנסת dβ לתוך Eq (5), אנו יכולים לחשב את הפיזור הליניארי, כמות עם יחידות של nm mm-1 באמצעות Eq (6):
(6)
עבור סורג עקיפה הפועל בתצורת ליטרו עם 1,851.85 חריצים/מ”מ, d = 540 ננומטר. אם נשתמש ב עקיפה מסדר ראשון של אור ב~ 789 ננומטר, D = 0.0027 rad nm-1. עם עדשת f = 750 מ”מ, אנו מקבלים פיזור ליניארי של ≈ 0.5 ננומטר מ”מ-1, המתורגם ≈ 7.8 ס”מ-1 מ”מ-1. לפיכך, אורך המוקד של העדשה קובע את “הצפיפות” של nm למ”מ במישור הגלאי: ככל שאורך המוקד ארוך יותר, כך מתקבל פחות ננומטר למ”מ, מה שמגדיל את הרווח בין הקווים הספקטרליים של משאבת הפס הרחב. לעומת זאת, עם אורכי מוקד קצרים יותר, יהיו יותר nm לכל מ”מ במישור הגלאי, מה שמקטין את השטח שתופסת המשאבה המפוזרת.
זיהוי מאוזן משפר את איכות התמונה ואת הרגישות של הגדרות רועשות. לדוגמה, על פי ספקטרום RIN המוצג באיור 8 ובהתחשב ב-SRS טיפוסי עם משרעת של 1 x 10-5, יחס האות לרעש הלא מאוזן (SNR) הוא ≈60. באמצעות זיהוי מאוזן (כלומר, קרוב לרעש הזריקה), ניתן להשיג SNR של ≈145. איור 11 מציג תמונות ספקטרום וקומפוזיציה בתנאים מאוזנים ולא מאוזנים. באופן טבעי, ההשפעות של גילוי מאוזן משפיעות על התוצאות הסופיות של הניסויים, כלומר על המפות הכימיות. בתמיכת תוצאות אלה, אנו מדגישים כי זיהוי מאוזן הוא טכניקה רבת עוצמה להתמודדות עם ההשפעות המזיקות של תנודות לייזר על איכות התמונה. ראוי להזכיר כי זיהוי מאוזן הוא המתאים ביותר עבור לייזרים רועשים, כגון מתנדים סיבים. מיקרוסקופי SRS הפועלים עם מקורות אור אופטיים שקטים (למשל, לייזרים במצב מוצק), עשויים שלא לדרוש זיהוי מאוזן.
הפרוטוקול גם מסביר גישה המבוססת על אופטיקה לא ליניארית למציאת החפיפה המרחבית-טמפורלית בין הפולסים של אלומות אלה. תיארנו את היתרונות של שימוש ב-1st במקום ב-0th diffraction-order של AOM בתור קרן סטוקס המאופננת. יתר על כן, ההשפעות המזיקות של פיזור על יעילות הדור SRS תוארו עם הצעות של דרכים למתן אותם באמצעות מדחס מנסרה. בנוסף, הפרוטוקול מסביר כיצד ליישר את המנסרות ומדגיש שלושה היבטים קריטיים שיש לקחת בחשבון לביצועים אופטימליים. אנו לא רק דנים ברלוונטיות של ה- RIN למיקרוסקופיית SRS, אלא גם מראים כיצד למדוד אותו באמצעות מגבר נעילה, ועם ספקטרום ה- RIN, להגדיר את תדירות המודולציה הטובה ביותר. עם דוגמה קונקרטית, מאמר זה מסביר כיצד משוואת הסורגים מסייעת בתכנון שרשרת הגילוי. לבסוף, הפרוטוקול ממחיש, עם נתוני SRS אמיתיים, את המבנה של hypercube SRS וכיצד לנתח אותו עם שפת תכנות מדעית בשימוש קונבנציונלי.
לפרוטוקול זה יש שלוש מגבלות קלות. ראשית, תוכנית הגילוי המשמשת בתרומה זו מורכבת מגלאי נעילה לא קונבנציונלי ורב-ערוצי שתוכנן ונבנה בתוך הבית על ידי Sciortino et al.26 כפי שהוכח בעבר25, ניתן להחליף גלאי זה בפוטודיודה מאוזנת מהמדף. למרות ששינוי זה נוגע רק לגלאי ומשאיר את הפרוטוקול כמעט ללא שינוי, עם פוטודיודה אחת, יש לסרוק כל רכיב ספקטרלי בגלאי במקום למדוד את כולם בבת אחת. שנית, פרוטוקול זה משתמש בזיהוי מאוזן בתוך השורה, הדורש החדרת מספר אלמנטים אופטיים לנתיב הקרן. אלמנטים אופטיים אלה מגבירים את מורכבות המערכת ומובילים לאובדן כוח אופטי והרחבת פולסים.
גילוי מאוזן מוטבע גם דורש ששני העתקי המשאבה יעברו דרך הדגימה, מצב שעשוי להיות לא אידיאלי עבור דגימות רגישות לאור, כגון תאים חיים, או עבור אלה דו-מפרגנים מאוד שבהם שני העתקי המשאבה עשויים לחוות תכונות אופטיות שונות, ובכך לבטל את הגילוי המאוזן. שלישית, הפרוטוקול מסתמך על OPO שנבנה בבית, מכשיר שייתכן שאינו זמין בקלות. עם זאת, חלופות לספקטרום הפס הרחב המסופקות על ידי OPO הן יבשת העל מסיבים אופטיים לא ליניאריים או גבישים בתפזורת. זה האחרון יכול להיות מועסק רק עם לייזרים בקצב חזרה נמוך (עד 5 MHz). לכן, כמו בכל תכנון ניסיוני, לפרוטוקול העומד על הפרק יש כמה מגבלות. עם זאת, הם מינימליים ואינם מתפשרים על הצלחתה של גישה זו.
למרות שמדגם ייחוס מתואר כאן, פרוטוקול זה יכול לנטרל בהצלחה מינים כימיים בתוך תאים ורקמות של בעלי חיים וצמחים, כגון תאית, מינים שומניים או חלבונים, ולמצוא יישומים מעשיים במשימות ביוכימיות שונות או ככלי אבחון בהיסטופתולוגיה. באופן דומה, פרוטוקול זה יכול להיות כלי רב ערך במדעי החומרים. לדוגמה, בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לחקור את ההרכב המולקולרי ואת הריכוז של מינים פולימריים42. יתר על כן, מתודולוגיה זו תואמת לטכניקות מיקרוסקופיה לא ליניאריות אחרות, כגון מיקרוסקופיה בפס רחב המבוססת על משאבה-בדיקה43 והטרודין CARS44, תהליכי ערבוב של ארבעה גלים, שכמו ב-SRS, דורשים גם שתי אלומות אור עירור ומדידות אפנון-העברה. לבסוף, ניתן ליישם חלק מהמידע הכלול במאמר זה על טכניקות הדמיה לא ליניאריות שאינן מסתמכות על טכניקות העברת אפנון, אלא דורשות יישור שתי קרני לייזר פולסים או יותר, כגון מכוניות קונבנציונליות45 ומיקרוסקופיות SFG46.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה רבת עוצמה המבוססת על מיקרוסקופיית SRS בפס רחב כדי לחלץ מפות כימיות וספקטרום SRS האופייני להן מתערובות הטרוגניות מבחינה כימית, ומספק מערכי נתונים המאפשרים ניתוח נתונים כמותי פשוט. הרבגוניות והפשטות של השיטה גם נותנות לקורא המעוניין את האפשרות להתאים אותה לטכניקות לא ליניאריות שונות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. P. מכיר במימון מפרויקט האיחוד האירופי CRIMSON במסגרת הסכם מענק מס ‘101016923 ופרויקט אזור לומברדיה NEWMED במסגרת הסכם מענק מס’. POR FESR 2014-2020. G. C. מאשרת מימון מפרויקט האיחוד האירופי GRAPHENE Core3 במסגרת הסכם מענק מספר 881603. G. C. גם מכיר במימון מאוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה, מספר פרס מענק: OSR-2016-CRG5-3017-01.
Materials
| Collection objective | Nikon | CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon | Oil immersion objective |
| Coverslips | Thermo Fisher | 043211-KJ | Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm |
| Delay line | Physik Instrumente (PI) | M-406.6PD | Precision microtranslation stage, 150 mm travel range |
| DMSO | Merck | D8418-500ML | Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide |
| Etalon | SLS Optics Ltd | Custom made | Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring |
| Excitation objective | Nikon | CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon | Water immersion objective |
| Grating | LightSmyth | T-1850-800s Series | High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series |
| Laser | Coherent | Custom made | Fidelity, HP |
| λ/2 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | Mounted superachromatic half-wave plate |
| PBS | Thorlabs | CM5-PBS203/M | 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube, |
| PMMA beads | Merck | MFCD00198073 | Micro particles based on polymethacrylate |
| Prisms | Crisel | 320-8218 | LASER DISPERSING PRISMS in SF11 |
| PS beads | Merck | 72986-10ML-F | Micro particles based on polystyrene |
| YVO4 crystal | Dr. Sztatecsny GmbH | Custom made | thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm |
References
- Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
- Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
- Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
- Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
- Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
- Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
- Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
- Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
- Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
- Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
- Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
- Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
- Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
- Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
- Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
- Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
- Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
- Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
- Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
- Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
- Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
- . Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
- Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
- de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
- Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
- Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
- Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
- Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
- RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise." Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
- Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
- Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
- Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
- Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
- Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
- Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).
