التصوير الكيميائي متعدد الإرسال القائم على مجهر رامان لتشتت رامان المحفز عريض النطاق
Summary
نقدم بروتوكولا للحصول على صور كيميائية باستخدام مجهر تفريق رامان (SRS) المحفز عريض النطاق. استنادا إلى مجهر SRS الذي يعمل مع الكشف التفاضلي متعدد القنوات ، يصف البروتوكول إعداد العينة ، وتعديل جهاز SRS ، والقياسات الكيميائية لفك تشابك المكونات المختلفة للعينات غير المتجانسة كيميائيا.
Abstract
المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية بصرية غير خطية للتصوير الكيميائي الخالي من الملصقات. توفر هذه الأداة التحليلية خرائط كيميائية بسرعة عالية ودقة مكانية عالية للعينات الرقيقة عن طريق استجواب اهتزازاتها الجزيئية مباشرة. في تنفيذه القياسي ، يكون الفحص المجهري SRS ضيقا النطاق ويشكل صورا بتردد اهتزازي واحد فقط في المرة الواحدة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يعيق الخصوصية الكيميائية ل SRS فحسب ، بل يهمل أيضا ثروة المعلومات المشفرة داخل الأطياف الاهتزازية.
ويمكن التغلب على هذه القيود بواسطة نظام SRS عريض النطاق، وهو تطبيق قادر على استخراج طيف اهتزازي لكل بكسل من الصورة بالتوازي. وهذا يوفر بيانات فائقة الطيف التي، عندما تقترن بالتحليل الكيميائي، تزيد من كمية المعلومات المستردة من العينة. وبالتالي ، فإن SRS عريض النطاق يحسن الخصوصية الكيميائية للنظام ، مما يسمح بالتحديد الكمي لتركيز المكونات المختلفة للعينة. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول للتصوير الكيميائي باستخدام مجهر SRS عريض النطاق ، استنادا إلى مجهر SRS محلي الصنع يعمل مع اكتشاف مضخم صوت متعدد القنوات تفاضلي مخصص. ويناقش إعداد العينة، ومحاذاة جهاز SRS، والتحليل الكيميائي. من خلال الحصول على أطياف رامان الاهتزازية ، يوضح البروتوكول كيفية تحديد الأنواع الكيميائية المختلفة داخل الخليط ، وتحديد تركيزاتها النسبية.
Introduction
مجهر رامان هو تقنية تصوير قوية توفر خرائط كيميائية غنية عن طريق قياس تشتت رامان1 ، وهي عملية إشعاعية غير مرنة تنشأ من جزيئات تهتز استجابة للضوء الساقط 2,3. يحتوي كل بكسل من خريطة رامان على طيف يحمل معلومات مباشرة عن التركيب الكيميائي للعينة وبنيتها، مما ينتج عنه صور ذات تباين اهتزازي جوهري. حتى الآن ، يعد مجهر رامان وجهة النظر المرجعية لدراسات التحليل الطيفي المجهري للاهتزازات الجزيئية حيث لا يمكن لأي تقنية تصوير أخرى إنتاج صور ذات خصوصية كيميائية عالية ودقة مكانية عالية4. وعلى الرغم من خصوصيته الكيميائية المتميزة، فإن كفاءة توليد تشتت رامان منخفضة، مما يستدعي إما أوقات سكن البكسل الممتدة أو الإثارة عالية الطاقة، مما يؤدي، على التوالي، إلى انخفاض معدلات الاكتساب وعدم التوافق مع العينات الحساسة.
هذا النقص الفردي في مجهر رامان دفع الباحثين إلى تطبيق تشتت رامان المتماسك5،6،7،8،9 كمصدر للتباين للفحص المجهري. هذه عملية بصرية غير خطية تعزز الاستجابة الاهتزازية بعدة أوامر (تصل إلى سبعة) من الحجم ، مما يسمح بالتصوير الكيميائي عالي السرعة10،11،12،13. وعلى وجه الخصوص، فإن تقنيتي تشتت رامان الأكثر تماسكا هما تشتت رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS)14 وتشتت رامان المحفز (SRS)15. على النقيض من CARS ، يظهر SRS اعتمادا خطيا على تركيز الجزيئات الرنانة. إنه محصن ضد الخلفية غير الرنانة ، وهو تأثير غير خطي لا علاقة له بأي انتقال اهتزازي ولكنه مشوه لأشكال لورنتزيان المميزة لأطياف رامان للاهتزازات الجزيئية16,17. وبالتالي ، فإن الفحص المجهري SRS ينتج معلومات رامان الأصلية التي تسمح بتحليل الصور الكمي المباشر.
SRS هي عملية بصرية غير خطية من الدرجة الثالثة توفر معلومات مباشرة عن الروابط الكيميائية للعينة. وهو ينشأ من التراكب الزماني المكاني لحقلين بصريين عموما في المنطقة الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء، وهما المضخة وستوكس عند التردد ωpu و ωS، على التوالي10،11،18. يولد هذا التراكب ضربا عند فك تشفير تردد المضخة ستوكس Ω = ωpu-ω S. عندما يتطابق Ω مع اهتزاز جزيئي ΩR ، يتردد صدى الجزيء ، مما يتسبب في نقل متماسك للطاقة بين حقول الضوء والجزيء. نتيجة لذلك ، يصل الجزيء إلى حالة إثارة اهتزازية. يمكن مراقبة هذه العملية عن طريق قياس إما إبادة فوتونات المضخة (إشارة تعرف باسم فقدان رامان المحفز [SRL]) أو التضخيم المصاحب لفوتونات ستوكس (وهي عملية تعرف باسم كسب رامان المحفز [SRG]). SRG و SRL هي إشارات صغيرة (ΔI) تجلس فوق خلفية مكثفة ومتقلبة (I). نظرا لأن القيم النموذجية لإشارة SRS (ΔI / I) تقع في نطاق 10-6-10-4 ، فإن ضوضاء الليزر يمكن أن تحجبها بسهولة. للتخفيف من الآثار الضارة لضوضاء الليزر على نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وبالتالي على سرعة التصوير ، يعتمد اكتشاف SRS على تقنيات نقل التشكيل (مثل مكبرات الصوت القفلية أو الدوائر الرنانة أو متوسطات السيارات الصندوقية) عند ترددات التشكيل العالية (>1 ميجاهرتز) ، حيث تصل ضوضاء الليزر إلى قيمها الدنيا15،19،20.
يستخدم الفحص المجهري SRS التقليدي مضخة ضيقة النطاق (≈10 سم−1) ونبضات ستوكس لإنتاج صور كيميائية بتردد اهتزازي واحد ، مما يسمح بالتصوير بمعدل الفيديو مع أوقات سكن البكسل منخفضة تصل إلى ≈100 ns21,22. ومع ذلك ، نظرا لأن الفحص المجهري SRS ضيق النطاق يشكل خرائط كيميائية عن طريق مسح العينة بالتتابع على عدد قليل من الترددات الاهتزازية ، فإن معلوماتها محدودة23. قد لا تكفي صور SRS ذات التباين الاهتزازي واحد أو اثنين للتمييز بين الأنواع الكيميائية ذات نطاقات رامان المتداخلة ، خاصة داخل الأنظمة غير المتجانسة. لذلك ، فإن مجهر SRS النموذجي ضيق النطاق لا يستغل الإمكانات الكاملة ل SRS ، لأن التحقيق في حفنة من الترددات الاهتزازية يعوق خصوصيته الكيميائية ويهمل ثروة المعلومات المشفرة داخل أطياف الاهتزاز. علاوة على ذلك، يؤدي المسح المتسلسل للعينة بترددات مختلفة إلى أوقات سكن البكسل الممتدة التي يمكن أن تؤدي إلى تلف ضوئي ومنع التسجيل المكاني الدقيق بين الصور المتتالية، مما يؤدي إلى قطع أثرية متحركة.
على عكس نظيره ضيق النطاق ، يسترد الفحص المجهري SRS عريض النطاق طيفا اهتزازيا لكل بكسل في كل عينة مسح10،12،24. وبالتالي ، يوفر SRS عريض النطاق تصويرا طيفيا فائقا مع تسجيل مكاني صارم للتباينات الاهتزازية المختلفة ، مما يسمح بتحليل دقيق للبيانات. هذا لا يكشف فقط عن المكونات الكيميائية للعينة من خلال أطياف رامان ، ولكنه يساعد أيضا على تحديد تركيزاتها النسبية. اعتمادا على كيفية الحصول على الأطياف ، يتم تصنيف الفحص المجهري SRS عريض النطاق إما على أنه SRS فائق الطيف أو SRS متعدد الإرسال. في SRS الفائق الطيف ، يتم الحصول على طيف SRS لكل نقطة ممسوحة ضوئيا من العينة بالتتابع (أي يتم استرداده عن طريق مسح التردد Ω) ، وبناء طيف SRS عن طريق تكديس إشارات SRS معا في نوبات رامان المتتالية. يتم قياس طيف رامان في وقت واحد في عدة أوضاع اهتزازية في SRS متعدد الإرسال. وهكذا، يجمع نهج SRS المتعدد الإرسال بين نبضة ضيقة النطاق معدلة ونبضة عريضة النطاق لدفع إشارة SRS بترددات مختلفة، ويستخدم كاشفا متعدد القنوات بحساسية مماثلة لحساسية SRS ضيقة النطاق للكشف عن أطياف SRS.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج خرائط كيميائية لعينات غير متجانسة باستخدام مجهر SRS متعدد الإرسالات. ويبين الشكل 1 مخططا لمجهر SRS المستخدم في هذا البروتوكول ويوصف بالتفصيل في مكان آخر25,26,27. باختصار ، يقوم ليزر ألياف Yb التجاري المقفل في الوضع ، والذي ينتج نبضات 140 fs مركزها 1040 نانومتر ، بمتوسط طاقة 10 واط ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز ، بتشغيل مجهر SRS عريض النطاق. يفصل مقسم الشعاع المستقطب (PBS) الحزمة الأساسية إلى فرعين. لإنتاج نبضات ستوكس ضيقة النطاق، يتم إرسال فرع واحد مع 4 واط من الشعاع الأساسي إلى etalon الذي يولد شعاع ضيق النطاق (≈15 سم-1)، والذي يتم تعديله بعد ذلك عند 1.6 ميغاهيرتز مع المغير البصري الصوتي (AOM). الجزء المتبقي مع 6 واط من الحزمة الأساسية يتضاعف التردد مع بلورة ليثيوم ثلاثية (LBO) بسماكة 2.8 مم ، مقطوعة لمطابقة المرحلة من النوع الأول (θ = 90 درجة ، φ = 13.8 درجة). ينتقل الجيل التوافقي الثاني الناتج عند 520 نانومتر إلى تجويف مطوي X لضخ مذبذب بصري بارامتري (OPO) ، وهو جهاز يستخدم بلورة LBO بسماكة 3.0 مم (مطابقة المرحلة من النوع الأول ، θ = 90 درجة ، φ = 9.8 درجة) كوسط نشط لتقديم إشعاع بصري عريض النطاق قابل للضبط داخل المنطقة الطيفية 680-910 نانومتر (الشكل 2). تعمل هذه النبضات عريضة النطاق كمضخة في تجارب SRS وتنتشر إلى ضاغط منشور للتعويض المسبق عن تأثيرات التشتت الناجمة عن هدف المجهر.
بعد مرحلة الضغط ، تنتج لوحة موجية λ/2 ، جنبا إلى جنب مع لوحة YVO4 ثنائية الانكسار ، نسختين متماثلتين مستقطبتين متعامدتين يلغي طرحهما الإلكتروني في مستوى الكشف ضوضاء مضخة النطاق العريض. تجمع المرآة ثنائية اللون بين المضخة وعوارض ستوكس وترسلها إلى مجهر مستقيم. ويركز هدف الغمر بالماء بفتحة عددية (NA) تبلغ 1.27 الضوء على العينة، بينما يقوم هدف غمر الزيت بفتحة غير متوقعة تبلغ 1.4 بتجميعه. قبل مرحلة الكشف، يزيل مرشح التمرير القصير (SPF) ستوكس المعدلة، بينما يعمل صريف الحيود الذي يعمل في تكوين Littrow على تشتيت مضخة النطاق العريض المرسلة. يفصل PBS2 الثاني النسخ المتماثلة للمضخة ، وتركز العدسة على صفيفين من الصمام الثنائي الضوئي. يتم طرح الإشارات من صفائف الصمام الثنائي الضوئي هذه إلكترونيا وإرسالها إلى مضخم صوت متعدد القنوات (M-LIA) تم بناؤه في المنزل. ثم يتم تطبيع الإشارة المسحوبة بواسطة قراءات التيار المباشر (DC) لأحد صفائف الصمام الثنائي الضوئي ، وبالتالي إنتاج طيف SRL.
كتجربة مثالية، نقوم بتصوير مخاليط من العديد من مبعثرات رامان المعروفة، ولكل منها طيف رامان فريد. وبالتالي ، يبدأ البروتوكول بوصف كيفية إعداد العينات المرجعية. بينما نكتشف SRL ، نواصل شرح كيفية الحصول على نبضات Stokes ضيقة النطاق وإعداد المصدر البصري الذي يوفر نبضات مضخة النطاق العريض (≈250 سم – 1) ، أي OPO محلي الصنع. ويبين البروتوكول محاذاة الحزم البصرية وتحسينها، واصفا البارامترات الحرجة مثل قدرة وأطياف ستوكس ضيقة النطاق ومضخة النطاق العريض. يصف البروتوكول بالتفصيل المسار البصري لمضخة النطاق العريض لأنه يتطلب عناصر بصرية خاصة. كما يشرح كيفية العثور على التداخل الزماني المكاني بين نبضات Pump-Stokes ويوضح طريقة عملية لتحديد ضوضاء الشدة النسبية (RIN) ، والتي بدورها تساعد في تحديد أفضل تردد تعديل لتجارب SRS. ثم نوضح مبدأ العمل ومعايرة سلسلة الكشف. أخيرا ، يعرض البروتوكول عملية الحصول على البيانات والقياسات الكيميائية وخط أنابيب معالجة الصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفحص المجهري SRS عريض النطاق هو تقنية تصوير قوية توفر تباينا كيميائيا حقيقيا لتحديد المكونات الكيميائية لعينة غير متجانسة وفك تشابكها. يمكن أن تكون إمكانات هذه الأداة التحليلية مفيدة للعديد من المجالات البحثية ، بدءا من علوم المواد إلى علم الأنسجة المرضية. الجانب السلبي للفحص المجهري SRS عريض النطاق هو حقيقة أنه يتطلب تقنيا. لا يتطلب التجريبيون فقط الدراية الفنية بمصادر الليزر عريضة النطاق ، بل يحتاجون أيضا إلى التعامل مع نبضات الليزر لتوليد SRS بكفاءة ، وهي إشارة تحتاج بدورها إلى قياسها باستخدام مخططات كشف متطورة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يصف سير العمل لإنتاج خرائط كيميائية للمركبات الكيميائية المختلطة باستخدام مجهر SRS عريض النطاق متعدد الإرسال. على الرغم من أن العمل الموصوف قد يكون تافها بالنسبة لبعض فيزيائيي الليزر والمجهريين غير الخطيين ، فقد لا يكون الأمر كذلك بالنسبة للقراء المهتمين بفوائد الفحص المجهري SRS عريض النطاق الذين توجد معرفتهم العلمية خارج هذه المجالات. لذلك ، كنا نهدف إلى تفصيل كل خطوة لتوجيه الجمهور الواسع المهتمين بالفحص المجهري SRS عريض النطاق.
بدأ البروتوكول المطروح بإظهار كيفية تحضير عينة بسيطة ولكنها غنية طيفيا تتكون من العديد من مبعثرات رامان القوية والمعروفة. ناقشنا كيفية الحصول على مضخة النطاق العريض وحزم ستوكس ضيقة النطاق اللازمة لإنشاء مجهر SRS. ويبين الشكل 5 جيم مخططا لإعدادات SHG وOPO. لاحظ أن العدسة f 1 تركز الشعاع الأساسي على LBO1 لتوليد SHG ، بينما تعكس المرآة ثنائية اللون إشعاع SHG وتنقل الحزمة الأساسية المتبقية. تقوم عدسة ثانية f2 بتجميع شعاع SHG. وبماأن f 2 > f 1، يتم توسيع شعاع SHG بعامل يساوي f2/f1. تركز العدسة الثالثة f3 شعاع SHG الموسع على بلورة LBO ثانية من النوع الأول (LBO2) مقطوعة عند θ = 90 درجة و φ = 29.0 درجة. من خلال ضخ LBO 2 مع SGH المذكور أعلاه (520 نانومتر) ، سيظهر الإشعاع داخل نطاق 680-910 نانومتر من LBO2 من خلال توليد تردد الاختلاف (DFG) ، مما ينتج حزمتين: الإشارة والخمول27 (الشكل 5D ، E). يتم التخلص من هذا الأخير بينما يتم تضخيم الأول في تجويف OPO لتوصيل نبضات المضخة المستخدمة في تجارب SRS. لا ينبغي الخلط بين مضخة OPO عند 520 نانومتر ، أي شعاع SHG ، ومضخة تجارب SRS (أي شعاع إشارة OPO).
ينشأ التباين في المجهر SRS من إشارة غير خطية يتم إنشاؤها في النقطة البؤرية للمجهر ، وهي إشارة تتطلب حصر عدد كبير من الفوتونات في مستوى العينة في وقت معين. يتم تحقيق حبس الفوتون هذا باستخدام هدف مجهر ذو فتحة عددية عالية (NA) ، وهو مجموعة من العدسات التي تحدد أيضا الدقة المكانية للنظام: كلما ارتفع NA ، زادت الدقة المكانية. ومع ذلك ، فإن أهداف NA العالية معبأة بكثافة بالزجاج ، مما يدخل GDD الإيجابي للإشعاع النبضي ، وهو زقزقة تردد توسع في النهاية المظهر الزمني للنبضات39. وبالتالي، فإن GDD الذي أدخله هدف المجهر قد يزيد من مدة نبضات مضخة النطاق العريض، مما يجعله أطول من المغلف الزمني ستوكس ويقلل من عرض النطاق الترددي الفعال الذي يمكن الوصول إليه لإشارة رامان. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي هذا التوسع أيضا إلى تشويه الملامح الطيفية لطيف SRS المقاس.
في CARS، تظهر الإشارة ذات الصلة طيفيا بأطوال موجية تختلف عن تلك الموجودة في حقول الإثارة. يمكن استخدام أنبوب مضاعف ضوئي بسيط أو كاميرا جهاز مقترن بالشحن (CCD) لدمج إشارة CARS في الوقت المناسب ، مما يلخص الآلاف من النبضات لمتوسط ضوضاء الليزر. بدلا من ذلك ، تظهر إشارة SRS كنقل تعديل باهت مضمن في خلفية ليزر قوية ومتقلبة. نظرا لأن هذا التعديل ضعيف ، يمكن لضوضاء الليزر أن تطغى عليه بسهولة ، مما يقلل من سرعة التصوير وحساسية مجهر SRS. لذلك ، قبل التصوير ، من الضروري قياس ضوضاء الكثافة النسبية (RIN) لتحديد ما إذا كان الليزر مناسبا لتصوير SRS عالي السرعة وتحديد تردد التشكيل بأقل ضوضاء. يتم تعريف RIN على أنه الكثافة الطيفية لقدرة الضوضاء [δP (f) ، مع وحدات W2 / Hz] لليزر التي يتم تطبيعها بواسطة متوسط الطاقة البصرية (
)40,41. وبعبارة أخرى ، يصف RIN تقلبات الليزر الطبيعية بترددات مختلفة (Eq [4]).
(4)
وبالتالي ، فإن RIN هي معلمة لنظام SRS تحدد نطاق تردد التشكيل المثالي للتجارب. على سبيل المثال ، يوضح شريط الزيتون في الشكل 8 نطاق تردد التشكيل المثالي لتصوير SRS. في حالة SRS ضيقة النطاق ، يجب على المستخدم قياس RIN لكل من المضخة و Stokes لاختيار الشعاع الذي يحتاج إلى تعديل لتحقيق الأداء الأمثل. لاحظ من الشكل 8 ، على سبيل المثال ، أن شعاع ستوكس يحتوي على RIN أعلى قليلا من المضخة ، مما يعني أن قياسات SRG ستتحول إلى أكثر ضوضاء من نظيراتها SRL. في حالة SRS عريض النطاق ، فإن الشعاع الذي يجب تعديله هو شعاع النطاق الضيق.
يعبر التشتت الزاوي D للصريف عن زاوية الحيود كدالة للطول الموجي ، ويتم تعريفه على أنه مشتق من معادلة الصريف. بالنسبة لتكوين Littrow ، يتم إعطاء التشتت الزاوي بواسطة Eq (5).
(5)
للحصول على Eq (5) ، افترضنا α = β ، وحلنا Eq (2) ل m / d وأدخلنا النتيجة في d β / d λ. لاحظ أنه في تكوين Littrow ، β = sin-1 (m λ / 2 d). ضمن تقريب الزاوية الصغيرة ، يكون التغير في الموضع على طول الطيف fdβ ≈ dl (الشكل 10). وبالتالي ، من خلال إدخال dβ في Eq (5) ، يمكننا حساب التشتت الخطي ، وهي كمية بوحدات nm mm-1 باستخدام Eq (6):
(6)
بالنسبة لصريف الحيود الذي يعمل في تكوين Littrow مع 1,851.85 أخدود / مم ، d = 540 نانومتر. إذا استخدمنا حيود الضوء من الدرجة الأولى عند ~ 789 نانومتر ، فإن D = 0.0027 rad nm-1. باستخدام عدسة f = 750 مم ، نحصل على تشتت خطي ≈ 0.5 نانومتر مم-1 ، مما يترجم إلى ≈ 7.8 سم – 1 مم – 1 مم – 1. وبالتالي ، يحدد البعد البؤري للعدسة “كثافة” nm لكل مم في مستوى الكاشف: كلما طالت البعد البؤري ، قل عدد nm لكل مم تم الحصول عليه ، مما زاد من المسافة بين الخطوط الطيفية لمضخة النطاق العريض. على العكس من ذلك ، مع الأطوال البؤرية الأقصر ، سيكون هناك المزيد من نانومتر لكل مم في مستوى الكاشف ، مما يقلل من المساحة التي تشغلها المضخة المشتتة.
يعمل الكشف المتوازن على تحسين جودة الصورة وحساسية الإعدادات الصاخبة. على سبيل المثال ، وفقا لأطياف RIN الموضحة في الشكل 8 وبالنظر إلى SRS النموذجي بسعة 1 × 10-5 ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء غير المتوازنة (SNR) هي ≈60. باستخدام الكشف المتوازن (أي بالقرب من ضوضاء اللقطة) ، من الممكن تحقيق SNR من ≈145. ويبين الشكل 11 الأطياف والصور المركبة في ظل ظروف متوازنة وغير متوازنة. بطبيعة الحال ، تؤثر آثار الكشف المتوازن على النتائج النهائية للتجارب ، أي الخرائط الكيميائية. بدعم من هذه النتائج ، نؤكد أن الكشف المتوازن هو تقنية قوية لمواجهة الآثار الضارة لتقلبات الليزر على جودة الصورة. تجدر الإشارة إلى أن الكشف المتوازن هو الأنسب لأشعة الليزر الصاخبة ، مثل مذبذبات الألياف. قد لا تتطلب مجاهر SRS التي تعمل بمصادر ضوء بصرية هادئة (مثل ليزر الحالة الصلبة) اكتشافا متوازنا.
يشرح البروتوكول أيضا نهجا يعتمد على البصريات غير الخطية للعثور على التداخل الزماني المكاني بين نبضات هذه الحزم. وصفنا مزايا استخدام 1st بدلا من ترتيب الحيود 0th ل AOM كشعاع ستوكس المعدل. علاوة على ذلك ، تم وصف الآثار الضارة للتشتت على كفاءة توليد SRS مع اقتراحات بطرق للتخفيف منها عبر ضاغط منشور. بالإضافة إلى ذلك ، يشرح البروتوكول كيفية محاذاة المنشور ويسلط الضوء على ثلاثة جوانب حاسمة يجب مراعاتها لتحقيق الأداء الأمثل. نحن لا نناقش فقط أهمية RIN للفحص المجهري SRS ولكن أيضا نعرض كيفية قياسه باستخدام مضخم صوت قفل ، ومع طيف RIN ، نحدد أفضل تردد للتشكيل. مع مثال ملموس ، تشرح هذه الورقة كيف تساعد معادلة الصريف في تصميم سلسلة الكشف. وأخيرا ، يوضح البروتوكول ، مع بيانات SRS الحقيقية ، بنية SRS hypercube وكيفية تحليلها باستخدام لغة برمجة علمية مستخدمة تقليديا.
يحتوي هذا البروتوكول على ثلاثة قيود طفيفة. أولا، يتكون مخطط الكشف المستخدم في هذه المساهمة من كاشف قفل غير تقليدي متعدد القنوات صممه وبناه Sciortino et al.26 وكما هو موضح سابقافي 25، يمكن استبدال هذا الكاشف بصمام ثنائي ضوئي متوازن جاهز. على الرغم من أن هذا التعديل يتعلق فقط بالكاشف ويترك البروتوكول دون تغيير تقريبا ، مع صمام ثنائي ضوئي واحد ، يحتاج المرء إلى مسح كل مكون طيفي على الكاشف بدلا من قياسها جميعا في وقت واحد. ثانيا ، يستخدم هذا البروتوكول كشفا متوازنا مضمنا ، مما يتطلب إدخال العديد من العناصر البصرية في مسار الحزمة. تزيد هذه العناصر البصرية من تعقيد النظام وتؤدي إلى فقدان الطاقة البصرية وتوسيع النبض.
يتطلب الكشف المتوازن المضمن أيضا أن تمر نسختا المضخة المتماثلتان عبر العينة ، وهي حالة قد لا تكون مثالية للعينات الحساسة للضوء ، مثل الخلايا الحية ، أو للعينات ثنائية الانكسار القوية التي قد تواجه فيها نسختا المضخة المتماثلتان خصائص بصرية مختلفة ، وبالتالي إلغاء الكشف المتوازن. ثالثا ، يعتمد البروتوكول على OPO محلي الصنع ، وهو جهاز قد لا يكون متاحا بسهولة. ومع ذلك ، فإن بدائل أطياف النطاق العريض التي يقدمها OPO هي الاستمرارية الفائقة من الألياف البصرية غير الخطية أو البلورات السائبة. لا يمكن استخدام هذا الأخير إلا مع ليزر معدل التكرار المنخفض (حتى 5 ميجاهرتز). وبالتالي ، كما هو الحال مع كل تصميم تجريبي ، فإن البروتوكول في متناول اليد لديه بعض القيود. ومع ذلك ، فهي ضئيلة ولا تعرض للخطر نجاح هذا النهج.
على الرغم من وصف عينة مرجعية هنا ، إلا أن هذا البروتوكول يمكن أن يفصل بنجاح الأنواع الكيميائية داخل الخلايا والأنسجة الحيوانية والنباتية ، مثل السليلوز أو الأنواع الدهنية أو البروتينات ، وإيجاد تطبيقات عملية في مهام كيميائية حيوية مختلفة أو كأداة تشخيص في علم الأنسجة المرضية. وبالمثل ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة قيمة في علوم المواد. على سبيل المثال ، بعد هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يستجوب التركيب الجزيئي وتركيز الأنواع البوليمرية42. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية متوافقة مع تقنيات الفحص المجهري غير الخطي الأخرى، مثل الفحص المجهري عريض النطاق القائم على مسبار المضخة43 و CARS44 غير المتجانس، وعمليات الخلط رباعية الموجات التي، كما هو الحال مع SRS، تتطلب أيضا حزمتين ضوئيتين مثيرتين وقياسات نقل التشكيل. وأخيرا، يمكن تطبيق بعض المعلومات الواردة في هذه الورقة على تقنيات التصوير غير الخطي التي لا تعتمد على تقنيات نقل التحوير، ولكنها تتطلب محاذاة اثنين أو أكثر من أشعة الليزر النبضية، مثل CARS45 التقليدي والفحص المجهري SFG46.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول منهجية قوية تستند إلى الفحص المجهري SRS عريض النطاق لاستخراج الخرائط الكيميائية وأطياف SRS المميزة لها من مخاليط غير متجانسة كيميائيا ، مما يوفر مجموعات بيانات تسمح بتحليل البيانات الكمية المباشرة. كما أن براعة وبساطة الطريقة تعطي القارئ المهتم إمكانية تكييفها مع التقنيات غير الخطية المختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر د. ب. بالتمويل المقدم من مشروع الاتحاد الأوروبي CRIMSON بموجب اتفاق المنحة رقم 101016923 ومشروع منطقة لومبارديا NEWMED بموجب اتفاق المنحة رقم بور FESR 2014-2020. G. C. تقر بالتمويل المقدم من مشروع الاتحاد الأوروبي GRAPHENE Core3 بموجب اتفاقية المنحة رقم 881603. كما تعترف G. C. بالتمويل المقدم من جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية ، رقم جائزة المنحة: OSR-2016-CRG5-3017-01.
Materials
| Collection objective | Nikon | CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon | Oil immersion objective |
| Coverslips | Thermo Fisher | 043211-KJ | Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm |
| Delay line | Physik Instrumente (PI) | M-406.6PD | Precision microtranslation stage, 150 mm travel range |
| DMSO | Merck | D8418-500ML | Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide |
| Etalon | SLS Optics Ltd | Custom made | Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring |
| Excitation objective | Nikon | CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon | Water immersion objective |
| Grating | LightSmyth | T-1850-800s Series | High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series |
| Laser | Coherent | Custom made | Fidelity, HP |
| λ/2 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | Mounted superachromatic half-wave plate |
| PBS | Thorlabs | CM5-PBS203/M | 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube, |
| PMMA beads | Merck | MFCD00198073 | Micro particles based on polymethacrylate |
| Prisms | Crisel | 320-8218 | LASER DISPERSING PRISMS in SF11 |
| PS beads | Merck | 72986-10ML-F | Micro particles based on polystyrene |
| YVO4 crystal | Dr. Sztatecsny GmbH | Custom made | thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm |
References
- Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
- Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
- Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
- Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
- Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
- Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
- Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
- Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
- Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
- Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
- Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
- Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
- Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
- Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
- Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
- Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
- Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
- Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
- Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
- Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
- Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
- . Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
- Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
- de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
- Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
- Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
- Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
- Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
- RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise." Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
- Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
- Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
- Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
- Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
- Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
- Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).
