Summary

Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos

Published: July 29, 2022
doi:

Summary

Este protocolo descreve a indução da sepse monobacteriana Gram-negativa em um sistema modelo de rato. O modelo é útil na investigação das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro durante a sepse.

Abstract

A sepse é uma resposta imune disregulada ao dano microbiano ou de tecido, levando a lesões de órgãos em um local distante do da infecção ou dano. Atualmente, os modelos de sepse amplamente utilizados incluem endotoxemia induzida por lipopolípido (LPS), ligante cecal e punção (CLP), e sistemas modelo de infecção monobacteriana. Este protocolo descreve um método para estudar as respostas do hospedeiro durante a peritonite séptica induzida por infecção por Salmonella Typhimurium em camundongos. S. Typhimurium, um patógeno intracelular gram-negativo, causa doença semelhante a tifoide em camundongos.

Este protocolo elabora a preparação da cultura, a indução de peritonite séptica em camundongos através de injeção intraperitoneal e métodos para estudar respostas sistêmicas do hospedeiro. Além disso, apresenta-se a avaliação da carga bacteriana em diferentes órgãos e a análise citométrica do fluxo do aumento do número de neutrófilos na lavagem peritoneal. Salmonella A sepse induzida por titriério em camundongos leva a um aumento de citocinas proinflamatórias e à rápida infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal, levando a uma menor sobrevivência.

Cada passo deste protocolo foi otimizado, resultando em alta reprodutibilidade da patogênese da peritonite séptica. Este modelo é útil para estudar respostas imunológicas durante a sepse bacteriana, os papéis de diferentes genes na progressão da doença e os efeitos das drogas para atenuar a sepse.

Introduction

A sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica disregulada e imune à invasão microbiana ou danos teciduais, levando à lesão de órgãos distante do local da infecção ou dano. O choque séptico é um subconjunto de sepse caracterizado pela hipotensão que persiste durante a ressuscitação do volume, com um risco substancialmente aumentado de mortalidade1. O público em geral tornou-se mais consciente desse transtorno durante a pandemia COVID-19. Apesar de sua alta mortalidade associada, faltam dados epidemiológicos abrangentes sobre a carga global da sepse devido à complexidade de seu diagnóstico. Em 2017, houve 48,9 milhões de incidências de sepse e 11 milhões de mortes em todo o mundo, representando 19,7% de todas as mortes globais2. Além disso, um estudo sobre a prevalência prolongada de infecção e sepse relacionada em pacientes de unidade de terapia intensiva constatou que 62% dos isolados positivos dos pacientes eram organismos Gram-negativos3.

Inicialmente, as investigações sobre sepse se concentraram na delineamento da patogênese microbiana. No entanto, compreender a “hipótese de perigo”, que dita como o hospedeiro distingue a si mesmo e a si mesmo, levou à inclinação do equilíbrio da pesquisa de sepse para entender a resposta do hospedeiro a um patógeno invasor. Os modelos de sepse amplamente utilizados incluem o modelo de endotoxemia induzido por lipopolípido (LPS), modelos de sepse polimicrobiana, ligação cecal e punção (CLP) e peritonite stent ascendentes de cólon (CASP), e modelos de infecção monobacteriana4.

Padronizamos um sistema de modelo de camundongos induzindo sepse peritoneal usando Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros porque Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular que imita a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, este modelo é fundamental no estudo das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro. Neste modelo, a sepse é induzida por injeção intraperitoneal de 0,5 milhões de unidades formadoras de colônias (UFC) de Salmonella Typhimurium em um rato C57BL/6 de 8-10 semanas de idade. A infecção sistêmica pode ser confirmada avaliando a carga bacteriana dos órgãos ~16 h após a infecção. Este artigo demonstra salmonella typhimurium-induced peritonitis sepse em camundongos, caracteriza as alterações resultantes na composição celular peritoneal, e quantifica a carga bacteriana em diferentes órgãos.

Protocol

Todos os experimentos utilizando Salmonella Typhimurium foram realizados nas instalações do Nível de Bio Segurança 2 (BSL-2). Deve-se tomar cuidado para utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, garantir a segurança e seguir os métodos padrão de descarte de risco biológico BSL-2. Todos os experimentos com camundongos foram realizados seguindo diretrizes do Comitê de Ética Animal Institucional, IISc. Os camundongos foram criados e mantidos no Centro de Animais do IISc (Número de r…

Representative Results

Uma caracterização detalhada da resposta imune do hospedeiro usando este modelo em particular é mostrada em publicações anteriores 8,9. Alguns resultados representativos do protocolo descrito são retratados nesta seção. Este modelo visa induzir a infecção sistêmica de S. Tiquitário por injeção intraperitoneal da cultura bacteriana para induzir a sepse. Para confirmar a infecção, os lises do fígado e do baço de camundongos sépticos fora…

Discussion

Este artigo descreve um método de induzir uma forma grave de sepse bacteriana por injeção intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros, pois Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular e, portanto, altamente patogênico, imitando a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, esse modelo é fundamental no estu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Centro de Animais, IISc, por nos fornecer ratos para pesquisa. Este estudo foi financiado por subvenções ao DpN do Departamento de Biotecnologia e Ciência e Pesquisa de Engenharia, Governo da Índia. O apoio infra-estrutural do programa DBT-IISc e das subvenções DST-FIST são muito reconhecidos. Agradecemos a todos os membros anteriores e atuais do laboratório dpn pelo apoio.

Materials

Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle Beckton Dickinson, Singapore 303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube Tarsons, USA 500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle Beckton Dickinson, Spain 307758
50 mL Conical Flask Tarsons, USA 441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546021
Cell spreader VWR, USA VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline HiMedia, Mumbai, India TS1006
Ethanol Merck 100983
FcR blocker BD Biosciences 553142
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551460
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Hand based Homogenizer
Hemocytometer (Neubauer counting chamber) Rohem, India I.S. 10269
Luria Bertani Broth HiMedia, Mumbai, India M1245
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petriplates Tarsons, USA 460091
RPMI Himedia, Mumbai, India AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar HiMedia, Mumbai, India M108
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Equipments
Centrifuge Kubota
Flow cytometer BD FACSverse
Incubator N-biotek
Spectrophotometer Shimadzu
Weighing machine Sartorius

References

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Cite This Article
Chattopadhyay, A., Joseph, J. P., Shyam, S., Nandi, D. Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63695, doi:10.3791/63695 (2022).

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