تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum
Summary
ويفصل هذا البروتوكول إعداد وتصور الأنسجة الثابتة لعذراء ذبابة الفاكهة (Drosophila pupal notum). يمكن استخدامه إما للأنسجة السليمة أو المصابة ، ويتم الحفاظ على البنية الأصلية للأنسجة. يتم وصف جميع إجراءات التشريح والتثبيت والتلطيخ في هذه المقالة.
Abstract
الشرانق من ذبابة الفاكهة melanogaster غير متحركة لعدة أيام أثناء التحول ، والتي خلالها تطوير جسم جديد مع تكامل الكبار شفافة رقيقة. إن جمالها وشفافيتها تجعلها مثالية لتجارب التصوير الحي في الجسم الحي . ركزت العديد من الدراسات على الطبقة الظهارية الظهرية الأحادية للنعومة العذراء بسبب إمكانية الوصول إليها وحجمها الكبير نسبيا. بالإضافة إلى دراسات الميكانيكا الظهارية والتطور ، كان notum نسيجا مثاليا لدراسة التئام الجروح. بعد الإصابة ، يمكن التقاط عملية الإصلاح الظهاري بأكملها عن طريق التصوير الحي على مدار 6-12 ساعة. على الرغم من شعبية notum للتصوير الحي ، إلا أن عددا قليلا جدا من الدراسات المنشورة قد استخدمت عينات notum الثابتة. يعد التثبيت والتلطيخ من الأساليب الشائعة لجميع أنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى تقريبا ، مستفيدين من الذخيرة الكبيرة من البقع الخلوية البسيطة والأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن notum العذراء هشة وعرضة للتجعيد والتشويه بعد إزالتها من الجسم ، مما يجعل من الصعب استكمال التصوير الحي. يوفر هذا البروتوكول طريقة مباشرة لإصلاح وتلطيخ العذراء ، سواء كانت سليمة أو بعد الجرح بالليزر. باستخدام هذه التقنية ، يتم لصق الجانب البطني من الخادرة على غطاء لشل حركة الخادرة ، ويتم إزالة الخادرة بعناية وتثبيتها وتلطيخها. يتم تركيب ظهارة notum على شريحة أو بين اثنين من أغطية لتسهيل التصوير من الجانب الظهري أو البطني للأنسجة.
Introduction
تم استخدام النعومة العذراء من ذبابة الفاكهة melanogaster بشكل متزايد لدراسات التصوير الحي في العقد الماضي لأن الحيوان غير متحرك ولديه بشرة شفافة في هذه المرحلة1،2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن notum العذراء يمثل تحديا في تشريحه وإصلاحه ، مما يجعل من الصعب استكمال دراسات التصوير الحية بالأجسام المضادة وتلطيخ الخلايا. الهدف العام من هذا العمل هو إنشاء بروتوكول قابل للتكرار لتشريح وإصلاح العذراء لتلطيخ الأجسام المضادة والخلايا على عينات جديدة أو تم تصويرها مسبقا على شكل صور حية.
عندما تبدأ اليرقات في التحول ، تسحب البشرة بعيدا عن بشرة اليرقات ، وتشكل حالة العذراء الصلبة8. يتم تقسيم خطة جسم اليرقات ، ويتم تطوير خطة جسم البالغين الجديدة. خلال هذا الوقت ، تكون الشرانق غير متحركة ، مما يجعلها مثالية للتصوير الحي. أحد الأنسجة التي يتم تصويرها بشكل شائع هو notum العذراء ، وهي ظهارة أحادية الطبقة للبالغين تتشكل في الصدر الظهري. يمكن الوصول إلى notum بصريا بعد تشريح بسيط لإزالة حالة العذراء9. يمكن بعد ذلك تركيب الحيوان بأكمله ، ويمكن تصوير النوتوم مباشرة لساعات أو أيام ، مما يجعله نسيجا مثاليا لدراسة سلوكيات الخلايا الظهارية أثناء التطور ، والتوازن ، وبعد الجرح10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن notum يصعب تشريحه وإصلاحه لأنه هش ومغطى ببشرة رقيقة شفافة للبالغين مسعورة. هذه البشرة الكارهة للماء تجعلها عرضة للتجعيد في المحاليل المائية عند إزالتها من بقية الجسم. وبالتالي ، لم يتم الإبلاغ عن تشريح وتثبيت notum إلا نادرا ، وغالبا ما لا يتم وصف التشريح15،16،17،18. بدون بروتوكول مفصل في الأدبيات ، من الصعب للغاية على باحث ذبابة الفاكهة استكمال التصوير الحي مع تلطيخ الشرانق.
تهدف هذه التقنية إلى تشريح وإصلاح العينات التي تم تصويرها مباشرة في السابق ، بما في ذلك تلك التي أصيبت بالليزر. نظرا لأن التصوير الحي يتطلب إزالة حالة العذراء ، تبدأ تقنية التشريح هذه بإزالة حالة العذراء الأمامية ، على عكس البروتوكولات السابقة التي تثبت أو تقسم الشرانق داخل حالة العذراء4،19،20. ال notum هو نسيج هش ، وقد يؤدي الجرح إلى تفاقم هشاشته. وبالتالي ، لدعم هذا النسيج الحساس ، يتم تشريح التكامل (الظهارة وبشرة البالغين الشفافة المرفقة) من notum وجزء من الرأس والبطن بعيدا عن بقية الخادرة بينما يتم غمرها دائما في بيئة مائية. هذه الطريقة تقلل من احتمال تجعيد الأنسجة وكونها غير صالحة للاستخدام. نجحت هذه التقنية في تلطيخ أنسجة النوتوم الجريحة في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الجرح (الشكل 1E-H) وفي 3 ساعات بعد الجرح (الشكل 1I-L). من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول فعالا طوال مدة تطوير الجرح أو إصلاح الجروح. ستكون التقنية الحالية مفيدة للباحثين الذين يرغبون في توحيد قدرات التصوير الحي للنعومة العذراء مع وفرة كواشف الكيمياء النسيجية المناعية المتاحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة
سيؤدي تحسين ثلاث خطوات إلى زيادة نجاح هذا البروتوكول بشكل كبير. أولا ، في الخطوة 1.5 ، كن متحفظا مع الغراء اللاصق المطبق على الغطاء. إذا تمت إضافة الكثير من الغراء اللاصق ، يمكن أن تصبح الشرانق مدفونة في طبقة سميكة من الغراء اللاصق الصلب ، مما سيجعل التشريح مستحيلا ، وإذا كان يغطي النوتوم نفسه ، فإن الغراء اللاصق سوف يحجب الضوء من العينة. ثانيا ، خلال الخطوات 2.3-2.6 ، تأكد من إزالة القبة العلوية فقط من النوتوم ، باستثناء أكبر قدر ممكن من الأنسجة الجانبية. إذا تم تضمينه ، ضغط الأنسجة الجانبية أثناء التركيب وتتسبب في ربط منتصف النوتوم إلى الداخل ، وغالبا ما تضعه خارج مسافة العمل لأهداف الفتحة العددية العالية. ثالثا ، أثناء خطوة التنظيف 2.9 ، يجب توخي الحذر الشديد لعدم إتلاف الظهارة أحادية الطبقة. إذا كان النسيج يحتوي على أجزاء كبيرة مفقودة أو لا يمكن اكتشاف أي إشارة ، فمن المحتمل أن تكون هذه الخطوة هي المسؤولة.
استكشاف الاخطاء
المشكلة 1: بعد التركيب ، تخرج الخادرة من الشريط على الوجهين أثناء التشريح. هذه مشكلة شائعة ، خاصة بالنسبة للمبتدئين. أفضل علاج هو التأكد من أن الجزء الخارجي من علبة الشرانق جاف تماما / خال من حطام الطعام. إن إزالة الطعام باستخدام زوج من الملقط الحاد والسماح للعلبة بالجفاف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة سيساعد على الالتصاق بالشريط. بدلا من ذلك ، استخدم اليد غير المهيمنة وزوجا من الملقط الحاد لتثبيت الشرانق على الشريط أثناء التشريح. إذا استمرت المشكلة ، فإن تطبيق قطرة صغيرة من طلاء الأظافر 5-10 ميكرولتر على قاعدة الطرف الخلفي من العلبة والسماح لها بالتصلب بشكل عام يوفر التصاق كاف حتى لأشد الشرانق جموحا.
المشكلة 2: ينهار Notum أثناء الخطوة 2.3 ، أو أن الخرق الأولي من خلال التكامل ليس سلسا. إذا كان من الصعب اختراق التكامل ، فقد يكون هناك الكثير من الغراء اللاصق من خطوات التجميد. سيؤدي وضع الشرانق المشوهة في غراء أقل لاصقا إلى تحسين هذه المشكلة. علاوة على ذلك ، تأكد من أن مقص التشريح المجهري حاد. لن يتمكن المقص الحاد من قطع التكامل ويميل إلى التسبب في انهياره إلى الداخل. بمجرد انسكاب الشرانق الليمفاوية من الشرانق ، تأكد من أن إحدى شفرات القطع يمكن أن تدخل الخادرة دون التسبب في تشوه النوروم. إذا انهارت الشفرة ولم تدخل الشفرة إلى الخادرة ، فاستمر في القص حتى تدخل شفرة إلى الشرانق.
المشكلة 3: أثناء الخطوة 2.4 ، يمسك المقص بالتكامل أو يسحبه. إذا بدأ المقص في التقاط أو سحب التكامل ، فغالبا ما يساعد على التبديل إلى الجانب الآخر من الشرانق والمضي قدما في “تخفيف” التكامل. المزيد من مقص التشريح المجهري الحاد سيجعل من الصعب تحقيق تخفيضات نظيفة من خلال التكامل ، ويجب استخدام مقص حاد.
المسألة 4: يتم شفط العينة عن طريق الخطأ أثناء التلطيخ (الخطوات 3.1-3.6). من الصعب رؤية النوتوم التشريحي لأنه شفاف. قد يكون من المفيد وضع ورقة زرقاء داكنة أو سوداء أسفل الغطاء لتوفير التباين (يعمل رف حامل طرف الماصة القديم بشكل جيد.) بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء جميع تغييرات الحل تحت مجهر التشريح.
المشكلة 5: لم يتم اكتشاف أي إشارة / تم اكتشاف إشارة غير مكتملة. بعد استبعاد المشاكل الخاصة بالبقع ، إذا لم يتم اكتشاف أي إشارة أو كانت غير مكتملة ، فمن المحتمل أن تكون الخطوة 2.9 (التنظيف) هي الجاني. يمكن أن تنشأ إشارة غائبة أو غير مكتملة من تلف وإزالة الأنسجة الظهارية أثناء التنظيف. على العكس من ذلك ، يمكن أن تحدث إشارة ضعيفة بسبب انسداد من عصابات العضلات / خلايا الجسم الدهنية إذا لم تتم إزالتها ، لأنها يمكن أن تحد من انتشار البقع والأجسام المضادة في النغمة بالنسبة للأنسجة المحيطة. في حالة تلف الأنسجة ، فإن كونك أكثر لطفا أثناء التنظيف هو الحل الأفضل. بدلا من ذلك ، إذا كانت البقعة مرئية ولكنها غير مكتملة ، فمن المستحسن زيادة النشاط / الوقت المخصص لخطوة التنظيف لإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والجسم الدهني. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد زيادة مدة البقعة في حل هذه المشكلة من خلال تنظيف أفضل.
المسألة 6: النسيج المخاطي له مظهر مشوه / مجعد أثناء التصوير. يأتي التواء وتجاعيد الأنسجة من مصدرين. أولا ، سيؤدي ضغط notum أثناء التركيب إلى إبزيمه وتشويهه. أفضل حل هو إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الجانبية بحيث تكون القبة قصيرة قدر الإمكان ويمكن أن تتناسب بين فواصل الغطاء. ثانيا ، إذا تم ثني notum أثناء التشريح ، فلن يتم تقويم هذا الانحناء أثناء التركيب ، لذلك يجب توخي الحذر الشديد لعدم تشويه النوتوم أثناء التشريح. الانحناء العرضي للنوتوم هو الأكثر شيوعا عند قطع التكامل بعيدا عن بقية الشرانق. من المغري أن يكون مقص التشريح بزاوية بالنسبة إلى الشرانق بدلا من الاحتفاظ بها في مستوى العينة مثل الشرانق. ومع ذلك ، يتسبب المقص ذو الزاوية في ربط التكامل لأعلى عند قطعه بدلا من البقاء مسطحا.
الأساليب الحالية والقيود والتطبيقات المستقبلية
أبلغ وانغ وآخرون 20 عن بروتوكول تشريح مماثل لعزل ظهارة العذراء. تتطلب هذه التقنية أن تبقى الخادرة داخل حالتها وأن يتم تقسيمها بسرعة باستخدام مشرط. هذا البروتوكول غير متوافق مع العينات التي تم تصويرها مسبقا على الهواء مباشرة، حيث يتطلب التصوير المباشر إزالة جزء كبير من علبة العذراء. نظرا لأن الشرانق تفتقر إلى الصلابة ، فإن التقسيم الثنائي للعذراء خارج العلبة يشوه الأنسجة ، مما ألهم إنشاء هذا البروتوكول. تسمح التقنية المفصلة هنا بعزل وتثبيت النوتوم ، ويمكن استخدامها كخطوة أولى لمجموعة واسعة من الطرق الأخرى مثل التقسيم بالتبريد أو التهجين في الموقع أو المجهر الإلكتروني.
هذه التقنية لها بعض القيود. أولا ، يعد تشريح وإصلاح وتلطيخ النوتوم أكثر استهلاكا للوقت من البروتينات الموسومة بالفلورسنت في التصوير الحي في النوتوم ، والتي لا تتطلب سوى تشريح بسيط لإزالة حالة العذراء 9,23. ثانيا ، بالمقارنة مع تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى ، فإن هذا التشريح أكثر صعوبة بسبب الأنسجة الرقيقة والهشة والبشرة الكارهة للماء. لمجرد تصور البروتينات في ظهارة ذبابة الفاكهة ، فإن الكيمياء النسيجية المناعية على الأجنة الثابتة أو أقراص جناح اليرقات أو المبيضين أسهل. ومع ذلك ، تسمح هذه التقنية بإقران قوة التصوير الحي بالتثبيت والتلطيخ ، مما يجعلها أداة قوية بمجرد إتقانها.
تقنية التشريح / التثبيت لها بعض المزايا على التصوير المباشر. يمكن حل الهياكل القاعدية (الداخلية) بشكل أفضل من خلال عرض قاعدي (الشكل 5L ، J). والأهم من ذلك، أن التصوير الحي يقتصر على الفلوروفورات التي يجب توفيرها وراثيا، وغالبا ما تتطلب مخططات عبور وراثية طويلة. وعلى النقيض من ذلك، يسمح البروتوكول الحالي بتطبيق البقع، والكيمياء النسيجية المناعية، وغيرها من التقنيات التي تتطلب تشريحا وتثبيتا. هذا يزيد بشكل كبير من عدد الإشارات التي يتم فحصها في الأنسجة مع احتمال تقليل الوقت اللازم للنتائج التجريبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور م. شين هوتسون على إنشاء نظام الاستئصال بالليزر المستخدم في جرح العذراء ومساهماته وملاحظاته على تطوير البروتوكول. تم دعم هذا العمل من قبل 1R01GM130130 إلى APM و M. Shane Hutson. تم دعم JW بواسطة 2T32HD007502-21.
Materials
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O’Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F., Bellen, H. J., Yamamoto, S. . Notch Signaling: Methods and Protocols. , 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al., Celis, J. E., et al. . Cell Biology (Third Edition). , 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
