Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos¹, inflamatório² e doenças infecciosas³, câncer ^4,5, bem como envelhecimento⁶, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de genes e síntese de ácidos nucleicos e replicação ^7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) está diretamente relacionada ao mau funcionamento da regulação da absorção de glicose. DM é um espectro de doenças crônicas como tipo-1, -2 e -3 diabetes mellitus, diabetes gestacional, diabetes de início de maturidade dos jovens e outros tipos dessa doença induzidas por fatores ambientais e/ou genéticos. Em 2016, o primeiro relatório global da OMS sobre diabetes demonstrou que o número de adultos vivendo com o DM mais difundido quase quadruplicou desde 1980 para 422 milhões de adultos¹⁰, e esse número de pacientes com DM tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas. Só em 2019, a estimativa de 1,5 milhão de mortes foi diretamente causada pelo DM¹⁰. Esse aumento dramático deve-se ao aumento do DM tipo 2 e às condições que o conduzem, incluindo sobrepeso e obesidade¹⁰. A pandemia COVID-19 revelou um aumento de duas vezes na mortalidade em pacientes com DM em comparação com a população geral, sugerindo o papel profundo, mas mal compreendido, do metabolismo da glicose na defesa imunológica³. Prevenção, diagnóstico precoce e tratamento de DM, obesidade e outras doenças requerem otimização das medidas de captação de glicose por diferentes tecidos, e identificação de fatores ambientais¹¹, nutricionais¹², endócrinos¹³,^{genéticos 14} e¹⁵ fatores epigenéticos que afetam a captação de glicose.

Em pesquisa, a absorção intracelular e/ou tecidual de glicose é comumente medida por glicose fluorescente (FD-glicose) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. A fD-glicose tornou-se um método preferido em comparação com métodos mais precisos usando glicose radioativamente rotulada²⁰, análise de espectroscopia de massa analítica²¹, metabolômica²², métodos de ressonância magnética nuclear²³ e tomografia/tomografia computadorizada de emissão de pósitrons (PET/CT)^5,24. Ao contrário da absorção de glicose FD, métodos analíticos que requerem mais material biológico podem envolver uma preparação de amostras em várias etapas, instrumentos caros e análise de dados complexos. Medições eficazes e baratas da absorção de FD-glicose nas culturas celulares têm sido utilizadas em experimentos de prova de conceito e podem exigir validação por outros métodos.

A base da aplicação de FD-glicose para estudos de absorção de glicose é o metabolismo reduzido de FD-glicose em comparação com a glicose endógena²⁵. No entanto, tanto a glicose endógena quanto a fd-glicose são distribuídas dinamicamente entre todos os compartimentos celulares para uso em processos anabólicos, catabólicos e de sinalização. A compartimentação e o processamento dependente do tempo²⁵ de FD-glicose interferem nas medidas de fluorescência, e representam os principais fatores limitadores para o uso deste ensaio em experimentos de triagem de alto rendimento, análise cinética, cultura celular 3D, co-culturas e experimentos de explant tecidual. Aqui, fornecemos dados demonstrando uma alta correlação entre o esgotamento extracelular da glicemia FD e sua absorção intracelular, sugerindo o esgotamento extracelular da fd-glicose como uma medida substituta para absorção intracelular de glicose. A medição do esgotamento extracelular da glicose foi aplicada para validar diferenças específicas de tecido na absorção de glicose em camundongos tratados com insulina e uma droga experimental¹⁸ para fornecer uma prova de princípio deste método.

O protocolo atual descreve medições intracelulares e extracelulares (Figura 1) da absorção de fd-glicose em células 3T3-L1. As seções de protocolo 1-7 explicam a cultura e o crescimento das células por 48 h; fome celular, estimulação e medidas extracelulares de linha de base; e medidas pós-estimulação de medidas extracelulares de FD-glicose e medidas intracelulares de FD-glicose e proteína. A seção 8 do protocolo descreve a medição ex vivo da absorção extracelular de fd-glicose em tecidos dissecados de camundongos ob/ob na presença e ausência de insulina e composto de aminoácidos 2 (AAC2) descritos em outros lugares¹⁸.