Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo
Summary
Extracellulaire depletie van fluorescerend gelabelde glucose correleert met glucoseopname en kan worden gebruikt voor high-throughput screening van glucoseopname in weggesneden organen en celculturen.
Abstract
De aanhoudende wereldwijde epidemie van diabetes verhoogt de vraag naar de identificatie van omgevings-, voedings-, endocriene, genetische en epigenetische factoren die de opname van glucose beïnvloeden. De meting van intracellulaire fluorescentie is een veelgebruikte methode om de opname van fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in cellen in vitro te testen, of voor het in vivo in beeld brengen van glucose-consumerende weefsels. Deze test beoordeelt de opname van glucose op een gekozen tijdstip. De intracellulaire analyse gaat ervan uit dat het metabolisme van FD-glucose langzamer is dan dat van endogene glucose, dat deelneemt aan katabole en anabole reacties en signalering. Dynamisch glucosemetabolisme verandert echter ook opnamemechanismen, die kinetische metingen van glucoseopname vereisen als reactie op verschillende factoren. Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van extracellulaire FD-glucosedepletie en valideert de correlatie met intracellulaire FD-glucoseopname in cellen en weefsels ex vivo. Extracellulaire glucosedepletie kan mogelijk toepasbaar zijn voor kinetische en dosisafhankelijke studies met hoge doorvoer, evenals het identificeren van verbindingen met glycemische activiteit en hun weefselspecifieke effecten.
Introduction
De vraag naar het meten van glucoseopname stijgt samen met de kritieke noodzaak om een epidemische toename van een groot aantal ziekten aan te pakken die afhankelijk zijn van het glucosemetabolisme. Onderliggende mechanismen van degeneratieve metabole ziekten, neurologische en cognitieveaandoeningen 1, ontsteking2 en infectieziekten3, kanker 4,5, evenals veroudering6, zijn afhankelijk van glucosemetabolisme voor energie en de opslag ervan, anabole processen, eiwit- en genmodificatie, signalering, regulatie van genen en nucleïnezuren synthese en replicatie 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) is direct gerelateerd aan een storing in de glucose-opnameregulatie. DM is een spectrum van chronische ziekten zoals type-1, -2 en -3 diabetes mellitus, zwangerschapsdiabetes, volwassenheidsdiabetes van jongeren en andere soorten van deze ziekte veroorzaakt door omgevings- en / of genetische factoren. In 2016 toonde het eerste who global report on diabetes aan dat het aantal volwassenen met de meest wijdverspreide DM sinds 1980 bijna is verviervoudigd tot 422 miljoen volwassenen10, en dit aantal DM-patiënten is de afgelopen decennia exponentieel gestegen. Alleen al in 2019 werd een schatting van 1,5 miljoen sterfgevallen direct veroorzaakt door DM10. Deze dramatische stijging is te wijten aan de toename van type-2 DM en de omstandigheden die het veroorzaken, waaronder overgewicht en obesitas10. De COVID-19-pandemie onthulde een tweevoudige toename van de mortaliteit bij patiënten met DM in vergelijking met de algemene bevolking, wat de diepgaande maar slecht begrepen rol van glucosemetabolisme in de immuunafweer suggereert3. Preventie, vroege diagnose en behandeling van DM, obesitas en andere ziekten vereisen optimalisatie van metingen van glucoseopname door verschillende weefsels en identificatie vanomgevingsfactoren 11, voeding12, endocriene13, genetische 14 en epigenetische15 factoren die de glucoseopname beïnvloeden.
In onderzoek wordt intracellulaire en/of weefselopname van glucose gewoonlijk gemeten door fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 en in vivo19. FD-glucose werd een voorkeursmethode in vergelijking met nauwkeurigere methoden met behulp van radioactief gelabelde glucose20, analytische massaspectroscopieanalyse21, metabolomica22, nucleaire magnetische resonantiemethoden23 en positronemissietomografie / computertomografie (PET / CT) 5,24. In tegenstelling tot de opname van FD-glucose, kunnen analytische methoden die meer biologisch materiaal vereisen, een monstervoorbereiding in meerdere stappen, dure instrumenten en complexe gegevensanalyse omvatten. Effectieve en goedkope metingen van FD-glucoseopname in celculturen zijn gebruikt in proof-of-concept-experimenten en vereisen mogelijk validatie door andere methoden.
De basis van FD-glucosetoepassing voor glucoseopnamestudies is het verminderde metabolisme van FD-glucose in vergelijking met endogene glucose25. Niettemin zijn zowel endogene glucose als FD-glucose dynamisch verdeeld over alle cellulaire compartimenten voor gebruik in anabole, katabole en signaleringsprocessen. De compartimentering en tijdsafhankelijke verwerking25 van FD-glucose interfereren met de fluorescentiemetingen en vertegenwoordigen de belangrijkste beperkende factoren voor het gebruik van deze test in screeningexperimenten met hoge doorvoer, kinetische analyse, 3D-celkweek, coculturen en weefselexplantexplantexperimenten. Hier bieden we gegevens die een hoge correlatie aantonen tussen de extracellulaire depletie van FD-glucose en de intracellulaire opname ervan, wat de extracellulaire uitputting van FD-glucose suggereert als een surrogaatmeting voor intracellulaire glucoseopname. De meting van extracellulaire depletie van glucose werd toegepast om weefselspecifieke verschillen in glucoseopname te valideren bij muizen behandeld met insuline en een experimenteel medicijn18 om een proof-of-principle van deze methode te bieden.
Het huidige protocol beschrijft intracellulaire en extracellulaire (figuur 1) metingen van FD-glucoseopname in 3T3-L1-cellen. Protocol secties 1-7 verklaren de cultuur en groei van cellen gedurende 48 uur; celuithongering, stimulatie en baseline extracellulaire metingen; en poststimulatiemetingen van extracellulaire FD-glucose en intracellulaire metingen van FD-glucose en eiwit. Protocol sectie 8 beschrijft de ex vivo meting van extracellulaire opname van FD-glucose in weefsels ontleed van ob/ob muizen in de aan- en afwezigheid van insuline en aminozuurverbinding 2 (AAC2) elders beschreven18.
Protocol
Representative Results
Discussion
De directe vergelijking van extracellulaire FD-glucosedepletie met genormaliseerde intracellulaire glucoseopname in celkweek toonde een hoge correlatie, wat suggereert dat extracellulaire glucosedepletie een surrogaatmeting zou kunnen zijn voor de beoordeling van de glucoseopname. De meting van extracellulaire FD-glucose kan een breed scala aan FD-glucoseconcentraties gebruiken, ook 0,5-2,5 μg FD-glucose / ml lijkt het optimale bereik te bieden. Extracellulaire FD-glucose vereist geen normalisatie naar celaantal of eiwi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd ondersteund door Ralph en Marian Falk Medical Research Catalyst Award en Kathleen Kelly Award. Andere ondersteuningen waren het National Center for Research Resources UL1RR025755 en NCI P30CA16058 (OSUCCC), de NIH Roadmap for Medical Research. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van het National Center for Research Resources of de NIH.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
