Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Nos últimos anos, o conhecimento da função astrócito e como eles interagem com circuitos neuronais aumentaram drasticamente. Os astrócitos podem influenciar a plasticidade ^1,2, auxiliar na recuperação neuronal da lesão^{pós-lesão 3,4}, e até induzir a potencialização neuronal de novo, com estudos recentes mostrando a importância dos astrócitos na aquisição e recompensa da memória, antes consideradas como funções puramente neuronais ^5,6,7 . Uma característica de particular interesse na pesquisa de astrócito é o arranjo espacial das células, que mantêm organizações espaciais únicas no hipocampo e outras estruturas cerebrais ^8,9,10. Ao contrário dos dendritos neuronais que se entrelaçam entre somata celular, os astrócitos hipocampais habitam territórios visualmente distinguíveis com ligeira sobreposição entre seus processos, criando domínios distintos 8,11,12,13. As evidências que sustentam a participação de astrócitos em circuitos neuronais não suportam a falta de descrição anatômica detalhada dessas populações e dos neurônios em seus domínios¹⁴.

Os procedimentos de transdução de vetores virais, juntamente com animais transgênicos (TG), têm sido popularizados como um acessório para investigar estruturas cerebrais, funções e interações celulares^15,16. A utilização de diferentes promotores permite o direcionamento de células específicas de acordo com suas propriedades genéticas, níveis de ativação^17,18 ou alvos de projeção. Diferentes vírus podem expressar diferentes fluoroforos coloridos em diferentes populações. Um vírus pode ser combinado com a expressão endógena de fluoroforos em TG, ou animais TG podem ser usados sem a necessidade de vírus. Essas técnicas são amplamente utilizadas para marcação neuronal, e alguns laboratórios começaram a usá-las com modificações especializadas para atingir outros tipos de células, como os astrócitos ^5,9,19.

A técnica CLARITY, descrita pela primeira vez em^{2013 20,21}, permite o estudo de fatias cerebrais grossas, tornando todo o cérebro transparente, deixando intactas as estruturas microscópicas. Combinando os dois métodos de transdução vetorial viral e limpeza tecidual- a opção de examinar as interações espaciais entre diferentes populações do tipo celular está agora disponível. A maioria dos estudos de interação astrócito-neurônio foram realizados em finas fatias cerebrais, resultando em imagens de astrócitos incompletos devido a seus grandes domínios, restringindo radicalmente o número de células analisadas. O uso da técnica CLARITY permite a caracterização de resolução unicelular de populações celulares em volumes em larga escala simultaneamente. Imagens fluorescentes marcadas populações de células em cérebros claros não fornecem resolução sináptica, mas permite uma caracterização completa das interações espaciais entre astrócitos e uma variedade de tipos de células neuronais.

Por essa razão, aproveitamos essas técnicas de última geração para investigar as propriedades dos astrócitos em todo o CA1 dorsal, imagens de toda lamina (Estrato Radiatum, camada piramimal e Stratum Oriens). Medimos dezenas de milhares de astrócitos (com penetração viral de >96%⁵), analisando assim as informações de toda a população astróctica em torno do CA1. Com penetração eficiente dos marcadores neuronais, pudemos registrar as interações entre toda a população de astrócitos ca1 e os quatro tipos de células neuronais-parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neurônios inibitórios VIP e células piramipelais excitatórias⁹.

Vários experimentos foram realizados usando uma combinação de fluorescência de animais TG e vetores virais de cores diferentes (todas as células inibitórias), enquanto outros (excitatório) utilizaram dois vetores virais expressando fluoroforos diferentes sob diferentes promotores⁹. Este artigo apresenta um protocolo detalhado, incluindo a marcação das células desejadas no cérebro, tornando o cérebro transparente usando um procedimento de CLARIDADE modificado, bem como imagens e análises de estruturas cerebrais completas, utilizando vários procedimentos e softwares.