Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

In den letzten Jahren hat das Wissen über die Funktion von Astrozyten und wie sie mit neuronalen Schaltkreisen interagieren, dramatisch zugenommen. Astrozyten können die Plastizität beeinflussen ^1,2, die neuronale Erholung nach einer Verletzung^{unterstützen 3,4} und sogar eine de novo neuronale Potenzierung induzieren, wobei neuere Studien die Bedeutung von Astrozyten für den Gedächtniserwerb und die Belohnung zeigen, die bisher als rein neuronale Funktionen angesehen wurden ^5,6,7 . Ein Merkmal von besonderem Interesse in der Astrozytenforschung ist die räumliche Anordnung der Zellen, die einzigartige räumliche Organisationen im Hippocampus und anderen Gehirnstrukturen aufrechterhalten ^8,9,10. Im Gegensatz zu den neuronalen Dendriten, die sich zwischen den Zellsomata verflechten, bewohnen Hippocampus-Astrozyten visuell unterscheidbare Territorien mit leichten Überlappungen zwischen ihren Prozessen, wodurch unterschiedliche Domänen^entstehen 8,11,12,13. Die Beweise, die die Teilnahme von Astrozyten an neuronalen Schaltkreisen unterstützen, unterstützen nicht das Fehlen einer detaillierten anatomischen Beschreibung solcher Populationen und der Neuronen in ihren Domänen¹⁴.

Virale Vektortransduktionsverfahren wurden zusammen mit transgenen Tieren (TG) als Werkzeugset zur Untersuchung von Gehirnstrukturen, -funktionen und Zellinteraktionen^{populär gemacht 15,16}. Die Verwendung verschiedener Promotoren ermöglicht das Targeting spezifischer Zellen entsprechend ihren genetischen Eigenschaften, Aktivierungsstufen^17,18 oder Projektionszielen. Verschiedene Viren können in verschiedenen Populationen verschiedenfarbige Fluorophore exprimieren. Ein Virus kann mit der endogenen Expression von Fluorophoren in TG kombiniert werden, oder TG-Tiere können ohne Viren verwendet werden. Diese Techniken werden häufig für die neuronale Markierung verwendet, und einige Labore haben begonnen, sie mit Modifikationen zu verwenden, die auf andere Zelltypen wie Astrozyten ^5,9,19 spezialisiert sind.

Die CLARITY-Technik, die erstmals ^{2013 20,21} beschrieben wurde, ermöglicht die Untersuchung dicker Hirnschnitte, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht und gleichzeitig die mikroskopischen Strukturen intakt lässt. Durch die Kombination der beiden Methoden – virale Vektortransduktion und Gewebereinigung – steht nun die Möglichkeit zur Verfügung, die räumlichen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltyppopulationen zu untersuchen. Die meisten Astrozyten-Neuronen-Interaktionsstudien wurden an dünnen Gehirnschnitten durchgeführt, was zu Bildern unvollständiger Astrozyten aufgrund ihrer großen Domänen führte, wodurch die Anzahl der analysierten Zellen radikal eingeschränkt wurde. Die Verwendung der CLARITY-Technik ermöglicht die gleichzeitige Charakterisierung von Zellpopulationen in großflächigen Volumina mit Einzelzellauflösung. Die Abbildung fluoreszierend markierter Zellpopulationen in klaren Gehirnen liefert keine synaptische Auflösung, sondern ermöglicht eine gründliche Charakterisierung der räumlichen Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und einer Vielzahl von neuronalen Zelltypen.

Aus diesem Grund nutzten wir diese hochmodernen Techniken, um die Eigenschaften von Astrozyten im gesamten dorsalen CA1 zu untersuchen und alle Lamina (Stratum Radiatum, Pyramidenschicht und Stratum Oriens) abzubilden. Wir haben Zehntausende von Astrozyten (mit einer Viruspenetranz von >96%⁵) gemessen und dabei die Informationen der gesamten astrozytischen Population um CA1 analysiert. Mit effizienter Penetranz der neuronalen Marker konnten wir die Wechselwirkungen zwischen der gesamten Population von CA1-Astrozyten und den vier Arten von neuronalen Zellen – Parvalbumin (PV), Somatostatin (SST), VIP-hemmenden Neuronen und exzitatorischen Pyramidenzellen⁹ – aufzeichnen.

Mehrere Experimente wurden mit einer Kombination aus Fluoreszenz von TG-Tieren und verschiedenfarbigen viralen Vektoren (alle inhibitorischen Zellen) durchgeführt, während andere (exzitatorisch) zwei virale Vektoren verwendeten, die verschiedene Fluorophore unter verschiedenen Promotoren exprimierten⁹. Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, einschließlich der Markierung der gewünschten Zellen im Gehirn, der Transparentmachung des Gehirns mit einem modifizierten CLARITY-Verfahren sowie der Bildgebung und Analyse kompletter Gehirnstrukturen mit verschiedenen Verfahren und Software.