Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus Kullanarak Enfeksiyöz Etiyolojinin Epilepsisi İçin Bir Model
Summary
C57BL / 6 farelerde Theiler’in murin ensefalomiyelit virüsü (TMEV) ile intraserebral enfeksiyon, insan hastalarda viral ensefalitin ve müteakip epilepsinin erken ve kronik klinik semptomlarının çoğunu çoğaltır. Bu yazıda TMEV modelinin virüs enfeksiyonu, semptomları ve histopatolojisi anlatılmaktadır.
Abstract
Epilepsinin ana nedenlerinden biri, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir enfeksiyonudur; Böyle bir enfeksiyondan kurtulan hastaların yaklaşık% 8’i sonuç olarak epilepsi geliştirir ve oranlar ekonomik olarak daha az gelişmiş ülkelerde önemli ölçüde daha yüksektir. Bu çalışma, enfeksiyöz etiyolojinin epilepsisinin modellenmesine ve yeni antinöbet bileşik testleri için bir platform olarak kullanılmasına genel bir bakış sunmaktadır. C57BL/6 farelerde Theiler’s murine encephalomyelit virüsünün (TMEV) stereotaktik olmayan intraserebral enjeksiyonu ile epilepsi indüksiyonu protokolü sunulmuştur ve bu protokol, insan hastalarda viral ensefalitin ve müteakip epilepsinin erken ve kronik klinik semptomlarının çoğunu çoğaltmaktadır. Ensefalit sırasında nöbet aktivitesini izlemek ve yeni bileşiklerin potansiyel antinöbet etkilerini tespit etmek için farelerin klinik değerlendirmesi açıklanmaktadır. Ayrıca, viral ensefalit ve hipokampal hasar ve nöroinflamasyon gibi nöbetlerin histopatolojik sonuçlarının yanı sıra spontan epileptik nöbetler gibi uzun vadeli sonuçlar da gösterilmiştir. TMEV modeli, SSS enfeksiyonunun bir sonucu olarak epilepsi gelişim mekanizmalarının araştırılmasına izin veren ilk translasyonel, enfeksiyon odaklı, deneysel platformlardan biridir. Bu nedenle, bir CNS enfeksiyonunu takiben epilepsi gelişme riski taşıyan hastalar için potansiyel terapötik hedefleri ve bileşikleri tanımlamaya da hizmet eder.
Introduction
Viral ensefalitin sık görülen sonuçlarından biri epileptik nöbetlerdir. Birçok viral enfeksiyon, enfeksiyonun akut fazı sırasında semptomatik nöbetleri tetikler; Bu tür nöbetler için risk halk arasında %20’nin üzerinde artmıştır 1,2,3. Enfeksiyondan kurtulan hastalar da enfeksiyondan sonraki aylar ila yıllar içinde kronik epilepsi gelişme riskinin% 4-20’sinde artmıştır 1,4. Theiler’in murin ensefalomiyelit virüsü (TMEV), viral ensefalit 5,6,7’nin bir fare modelinde akut ve kronik nöbetleri incelemek için uygun bir virüs olarak tanımlanmıştır. TMEV, Picornaviridae ailesinin zarfsız, pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür ve geleneksel olarak C57BL / 6 (B6) farelerinin korunduğu SJL farelerinin omuriliğindeki demiyelinizasyonu incelemek için kullanılmıştır, çünkü enfeksiyondan sonra virüsü hızla temizleme yeteneğine sahiptirler. Bununla birlikte, TMEV, enfeksiyon sonrası ilk hafta (pi) içinde erkek ve dişi B6 farelerinin% 50-75’inde akut nöbetlere neden olurken, yaklaşık% 25-40’ında kronik epilepsi haftaları ila aylar pi 2,5,6,8,9 gelişir. Nöbetlerin yanı sıra, fareler ayrıca nörodejenerasyon ve gliyoz 5,6,8,10,11,12 ile epileptik hipokampüsün ortak histopatolojisini gösterir. Ayrıca, TMEV ile enfekte B6 fareleri, öğrenme ve hafıza için davranışsal testlerde önemli ölçüde daha kötü performans gösterir ve epilepsili klinik hastalarda da görülen bilişsel komorbiditeye sahiptir13,14,15.
Geleneksel olarak, epilepsi ve nöbet modelleri, nöbetleri indüklemek için kemokonvülsan maddelerin veya elektriksel stimülasyonun uygulanmasını kullanır; Bununla birlikte, bu modeller yapı geçerliliğinden yoksundur ve sıklıkla klinik hastalarda görülenden daha ciddi nöbetler ve beyin hasarı gösterir16. Her araştırma sorusuna uygun bir model yoktur17. TMEV modelinin kullanılması, MSS’nin bir enfeksiyonundan sonra nöbet gelişiminin predispozan faktörleri araştırıldığında veya bileşiklerin antinöbet etkinlikleri açısından tarandığında özellikle ilginçtir.
TMEV modeli uluslararası olarak birkaç farklı laboratuvarda kurulduğundan ve kullanıldığından, yazarlar modelin başarılı bir şekilde uygulanmasına izin veren birçok ayrıntıyı, örneğin farklı virüs ve fare suşlarının özgüllüğünü tanımlamışlardır. En güvenilir nöbet indüksiyonu, Daniel’in TMEV ve B6J farelerinin 2,5,6,8,9 suşu ile üretildi. Model şu anda Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) tarafından epilepsi ve nöbetlere karşı yeni ilaçları tanımlamak için bir platform olarak kullanılmaktadır18,19. Bu makale, diğer araştırmacıların hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılması ve ilaç testi için bu viral ensefalit modelini kullanmalarına izin vermek için virüs indüksiyonu ve klinik izlemenin ayrıntılı protokolünü içermektedir.
Aşağıdaki protokol, bu modelde bileşik test için tasarlanmış bir çalışmayı yansıtmaktadır, ancak çok sayıda başka çalışma türü gerçekleştirilebilir. Fareler, sağ yarımkürenin temporal bölgesinde (sağ göze posterior ve medial) Daniel’in TMEV suşu ile enjeksiyondan kısa bir süre önce uyuşturulur. Araştırma sorusuna bağlı olarak, enfekte olmayan kontrol hayvanlarına ihtiyaç duyulursa, fareler TMEV yerine steril fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4, KH 2 PO 4 [1.06 mM], NaCl [155.17 mM] ve Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2.97mM]dahil) alırlar. TMEV ile enfekte olmuş farelerde önceki deneyimler, elleçlemeye bağlı nöbetlerin enfeksiyon sonrası 3. gün ile 7. gün arasında meydana geldiğini göstermiştir. Deneysel bileşiklerin enjeksiyon sıklığı, yolu ve test zamanı, özelliklerine göre değişir. Virüs aşılamasının bir Cuma günü yapılması önerilir, bu da 3-7. gün nöbet izlemenin ertesi hafta, Pazartesi-Cuma günleri gerçekleşmesine izin verir. Nöbet izleme haftası boyunca, deneysel bileşikler, bileşiğin kinetiği veya etki mekanizması tarafından aksi önerilmedikçe, günde iki kez (en az 4 saat arayla) uygulanabilir (i.p.). Tedavi sırasında nöbet izleme, önceden belirlenmiş bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Enjeksiyon ve gözlem süreleri bireysel bileşiklere bağlı olarak değişir. Hayvanlara test bileşiği veya ilaç bileşiği yerine bir araç enjekte edilir. Bu iki grup, deney grubuna benzer şekilde ele alınabilir ve gözlemlenebilir. Deney sırasında, fareleri ele alan ve nöbetleri puanlayan bir kişi tedaviye kör edilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu, epilepsi için akut ve kronik nöbet gelişiminin araştırılmasına izin veren ilk enfeksiyon bazlı kemirgen modelidir. Epilepsinin en yaygın etiyolojilerinden biri için hastalığın önlenmesi veya modifikasyonu için ilaç hedeflerinin ve yeni bileşiklerin belirlenmesine yardımcı olacaktır.
Yukarıda tarif edildiği gibi, TMEV ile tedavi edilen farelerin yeterli bir oranının elleçlemeye bağlı nöbetler göstermesini sağlamak için parti ve viral titrenin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekebilir. Hayvanların normalden daha az nöbeti varsa, virüs verimliliğini doğrulamak için bir grup N = 20 hayvan kullanın. Aktivitesi azalırsa (% 50’den az), yeni alikotlar yapmanın ve bunları N = 20 hayvanlarla test etmenin zamanı gelmiştir. Yeni alikotlar daha verimli değilse, virüsün yeni bir partisi saflaştırılmalıdır. Bazı transgenik fare çizgileri için, daha düşük bir viral titre kullanmak gerekebilir; Bu nedenle, viral titre ön deneylerden sonra gerektiği gibi seyreltilmelidir. B6 fareler üzerinde mevcut verilerin çoğu Jackson Laboratuvarlarından (Bar Harbor, ME, ABD veya Charles River, Sulzfeld, Almanya) kaynaklanmaktadır; Bununla birlikte, Harlan’dan (Eystrup, Almanya) elde edilen B6 farelerinde benzer nöbet oranları doğrulanmıştır8. B6 arka plana sahip transgenik hayvanların nöbet oranları vahşi tip B6 farelerle karşılaştırılabilir, ancak genetik değişikliklerin virüs istilası, enflamatuar yanıt veya nörodejenerasyon üzerinde bir etkisi varsa farklılık gösterebilir21. Akut nöbetler kendiliğinden gözlenir, ancak kullanım ve gürültü ile tetiklenir, bu nedenle nöbet oranları karşılaştırılırken tüm hayvanların benzer şekilde ele alınması son derece önemlidir. Günde iki kez yapılan elleçleme seansları daha önce yüksek bir nöbet yükü ve enfeksiyondan sonraki 3-7. günlerde nöbet gösteren farelerin daha büyük bir oranını sağlamıştır 6,8,19. Nöbet yükünü artırmak için ek elleçleme seansları (gün 1 ve gün 2) de kullanılabilir. Ayrıca, spontan nöbetlerin meydana gelmediğinden emin olmak için her kullanım seansından önce hayvanlar gözlemlenebilir. Örneğin, yüksek sesli bir laboratuar ortamı, nöbetler üretebilir ve bu da hayvanları test zamanlarında elleçlemeye bağlı nöbetlere karşı dirençli hale getirebilir.
TMEV enfeksiyonu farelerin çoğunda elleçlemeye bağlı nöbetler üretirken, bazı hayvanların neden bu tedaviye dirençli olduğu bilinmemektedir. Yukarıda tarif edildiği gibi, elektrografik nöbetler (minimal veya hiç ilişkili davranışla) meydana gelebilir ve eşzamanlı EEG kaydı olmadan normal olarak ölçülemez. Ayrıca, enjeksiyon yerindeki küçük farklılıkların beyindeki viral etkinin azalmasını kolaylaştırması da olabilir; Bununla birlikte, virüsün hipokampusa tropizmi nedeniyle kortikal ve striatal enfeksiyon 5,6,8,9 sonrası nöbetler bildirilmiştir. Bu modeldeki uyuşturucu tarama çalışmaları için, nöbetlerde bir azalma (örneğin, nöbet yükünde% 50’lik bir azalma) tanımlamak için, her grup için daha fazla sayıda hayvan gereklidir (örneğin, N = 20). Ayrıca, bu modeldeki nöbet davranışlarındaki değişkenlik, önemli bir nöbet azalmasını tanımlamak için ilaç ve araç etkilerinde daha büyük farklılıklar gerektirmektedir. Bu nedenle, bu modelin bir sınırlaması, daha büyük grup boyutları için gerekliliktir. Bununla birlikte, yeterli grup büyüklükleri, bu model19’da anti-nöbet ve anti-enflamatuar etkilerin tanımlanmasına da izin vermektedir.
Bu modeldeki gözlemlenebilir nöbetlerin büyük çoğunluğu akut enfeksiyon döneminde ortaya çıkar. TMEV ile tedavi edilen farelerde hipokampal dejenerasyon, bağışıklık hücresi aktivasyonu ve bilişsel eksikliklerin ortaya çıkmasına rağmen, tedavi edilen hayvanların sadece küçük bir kısmı sonunda kronik, spontan nöbetler geliştirir. Bu düşük genel nöbet yükü, birçok projenin kapsamı ve kapasitesinin ötesinde olan bu modelde spontan nöbetleri düzgün bir şekilde incelemek için çok sayıda enfekte fare gerektirecektir. Derinlik elektrodu implantasyonu ve EEG izlemesi de deney hayvanları üzerindeki yükü artıracaktır. Derinlik elektrotları spontan nöbet aktivitesinin tanımlanmasına yardımcı olabilirken, enfeksiyonu takiben hipokampal anatomideki değişiklikler tutarlı elektrot yerleşimini zorlaştırabilir.
Epilepsi için yeni tedavilerin belirlenmesinin acil ihtiyacı, antinöbet etkinliği için hızlı bir tarama yöntemi olarak kullanılabilecek modellerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu model, bu acil isteği karşılamak için özellikler sağlar. Ayrıca, herhangi bir stereotaktik cerrahi gerektirmemesi, onu antinöbet bileşiklerinin araştırılması için uygun ve uygulaması kolay bir model haline getirmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SB, FU Berlin’in başlangıç hibesi ile desteklenmektedir. KSW, R37 NS065434 ve ALSAM Vakfı tarafından desteklenmektedir. LAB, 1F99NS125773-01 D-SPAN ödülü ile desteklenmektedir. Robert Fujinami, Ph.D.’ye Theiler virüsünü bize sağladığı için ve mikroskopi desteği için Utah Üniversitesi Hücre Görüntüleme Çekirdek Tesisi’ne teşekkür ederiz.
Materials
| Absorbent paper | – | – | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | – | – | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, 13-18 (2008).
- Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler’s virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler’s virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler’s virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler’s murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
