Theilerマウス脳脊髄炎ウイルスを用いた感染病因のてんかんモデル

記載されているすべての手順は、それぞれの当局によって承認されました。動物は、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(国立研究評議会)の推奨事項に従って、公衆衛生サービスの方針とユタ大学の施設動物管理および使用委員会、動物プロトコル(番号:21-11009、薬理学および毒物学部)およびベルリン自由大学(プロトコル:G0015 / 21、 LAGeSoベルリン、薬理学および毒物学研究所)、それぞれ。図 3 および 図5 に示す結果は、33.9-42502-04-11/0516および33.9-42502-04-15/1892(LAVES Oldenburg、ハノーバー獣医大学薬理学、毒物学、および薬学部)の下で承認されました。 1.研究を設計するための考慮事項と準備 ウイルスTMEVのダニエル株は、ユタ大学のロバート・フジナミによって親切に提供されました。もともとは、ハーバードコロニー20のマウスから単離された。TMEVを取り扱う前に、各国の生物製剤の具体的な分類や規制を調べ、機関のバイオセーフティ担当者と協議して、規制の遵守を確保してください。典型的には、TMEVは、株および遺伝子組み換えに応じてBSL2として分類される。大多数の動物において発作を誘発するのに必要な標準用量は、3 x 105 プラーク形成単位(PFU)である。注:トランスジェニックマウスを使用する場合など、用量を調整する必要があるかもしれません。全体として、2 x 104 PFUと2.44 x 107 PFUの間の力価は、発作をうまく誘発するために使用されています。対照動物は無菌PBSを受け、発作を経験しない。ウイルスは人間に感染しません。ただし、実験者は常にPPE(白衣、手袋、安全メガネ)を着用し、マウスの死骸と寝具は廃棄する前にオートクレーブ滅菌する必要があります。 動物発作の誘発と調査には、他のマウス系統、例えばSJL/J、FVB/N、またはBalb/cマウス5など、必ずしも発作を示さないため、B6Jマウスを使用してください。急性発作頻度5において雌マウスと雄マウスの間に差はない。青年期から成体マウス(5〜6週齢から開始)で実験を行う。 ダイエット食事療法は、疾患の重症度の実験室間の変動性の1つの原因として決定されています。したがって、食事をバリエーション22の潜在的な要因と見なしてください。 グループサイズこのモデルではすべての動物が急性または慢性の発作を発症するわけではないため、複合試験には約20匹のマウス/グループを使用してください。 動物福祉いずれかのマウスが治験化合物の感染または投与による重大な副作用を示す場合(例:.、嗜眠、身だしなみ不良、過度の発赤、および創傷からの化膿性分泌物)地域のIACUCガイドラインによって決定された観察時間(例:.、48時間)、マウスを人道的に安楽死させます。. 感染期間中に極端な体重減少(>20%)を示すマウスを人道的に安楽死させます。. 動物が適切に食べない場合は、小児用電解質溶液などで湿らせた補助ペレットへのアクセスを与えてください。 2.ウイルス接種 注射器の滅菌インスリン注射器のキャップを取り外します。針の周りのカラーとしてポリエチレンチューブを追加して、2.5mmの適切な注入深さを確保します。シリンジをエタノールに30分間浸します。シリンジをUV光の下に30分間置きます。 キャップを針に戻します。シリンジを滅菌ポーチで包み、テープで閉じます。準備日をラベル付けします。 ウイルスインジェクションダニエルのTMEV株のアリコートを-80°Cの冷凍庫から取得します。ウイルスを解凍し、氷の上に保管します。ウイルスの解凍と再凍結は避けてください。シリンジにウイルス懸濁液(20 μLのPBSまたはDMEM培養培地で希釈した3 x 105 PFU)をロードします。注意:このウイルスはマウスに感染しますが、人間には感染しません。 消毒剤でベンチを掃除し、ヒュームアブソーバーの下で作業します。ウイルス接種は無菌ではありませんが、可能な限り清潔です。 マウスを麻酔導入チャンバーに移し、酸素中の2%イソフルランを使用して麻酔を誘発します。外科的耐性に達するには数分かかります。動物の呼吸と麻酔の深さに基づいて濃度を調整します。 麻酔をかけたマウスをフードの下の麻酔ボックスから移します。つま先のつまみなどによる外科的耐性を確認します。手順全体が30秒未満で行われるため、動物は注射中にイソフルランを吸入する必要はありません。角膜の乾燥を防ぐために目の軟膏を追加します。 アルコールパッドで動物の頭をきれいにします。マウスの頭を少し左に傾けて、注射部位が上を向くようにします。 皮膚を少し後方に引っ張り、針を頭に挿入し、右半球の側頭領域(右眼の後方と内側)に2.5mmの深さまで皮質内に20μLを注入します。 すべての動物で同じ半球で一方的に注射を行います。頭頂皮質の位置の目印として目と耳を使用します。配置は以前に組織学的に検証されています。 図1を参照してください。ブレグマに対する定位固定装置注射による注射座標は−2.0(AP)である。+3.0 (ミリリットル);−1.5 (DV) シリンジを5〜15秒間そのままにします。注射による漏れがある場合、または気泡が見られる場合は書き留めてください-その場合は、新しい注射器を準備します。シリンジを慎重に引き抜くときは、少し回転させます。麻酔下での乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。 オプション:地域の手順に応じて、尾または耳に動物をコーディングします(オプションですが、動物は無意識であるため簡単です)。 動物を新しいケージに移し、麻酔からの回復中に加熱パッド(35〜40°C)を半オン/半オフします。動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。.注:動物は回復後に再びグループ収容することができます(感染した動物は模擬感染した動物と混合されません)。感染したマウスは、非感染マウスと同じ部屋に収容すべきではありません。 マウスは感染後に体重が減り、追加の給餌が必要になる可能性があるため、最初の7日間のマウスの体重を追跡します。 図1:TMEV注入手順の概略図。 左から右へ:右頭頂皮質注射の場合、針は目と反対側の耳の間の想像線のわずかに外側に注入されます。深度制御用のカラーは黄色で示されています。注射管は、矢印でマークされた冠状脳の断面に見ることができます。注入部位は、矢印の上に与えられた座標に対応する。右の画像は、海馬層のCA1内のタイラーウイルス(バイオレット)の分布を示しています。図は biorender.com を使用して作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.複合試験 コンパウンド調製処方手順を確認してください。推奨事項または提供された指示に従って車両ソリューションを準備します。一例として、抗てんかん薬レベチラセタム(LEV)の手順が提示される。LEVは、350 mg / kgの用量で発作の負担を車両レベルの30%〜40%に軽減します。この研究で使用されたビヒクルは0.5%メチルセルロースです。 化合物に応じて用量を計算します。計算に従って薬の重さを量ります。1 kgのマウスを治療するために、350 mgのLEVを体重測定します。 製剤指示書の指示に従って、適切な量のビヒクル溶液(例えば、超音波処理、ビヒクル賦形剤など)を用いてストック溶液を調製する。マウスの注射量が0.01 mL / gであることを考慮すると、1 kgの注射量は350 mgのLEVで10 mLになり、35 mg / mLの溶液が得られます19。計算と用量をmg / kgで、容量をmLで報告してください。注:例示的なプロトコルは、 補足資料1の2ページにあります。 化合物投与ケージを車両またはコンパウンドグループにランダム化します。てんかん発症のメカニズムに関する研究や検証目的で模擬感染マウスを使用しますが、定期的な薬物スクリーニングには使用しないでください。 温度、湿度、時刻などの環境条件を報告します。 コンパウンドとビヒクル溶液で溶液をボルテックスします。シリンジ内のビヒクルまたはコンパウンドを吸引し、シリンジを色分けして取り違えを防ぎます。 動物の体重を量ります。B6Jマウスが3日目に18 g>であることを確認してください pi (丸めなし)。体重を報告してください。 化合物を投与する(例えば、腹腔内注射または他の適切な経路によって)。投与の時間とルートを書きます。 化合物投与後、特に最初の注射後の行動の変化について動物を監視します。.発作が発生した場合は、ラシーンスケール23に従って発作強度を報告します。ステップ 3.2 を参照してください。注:化合物投与の例示的なプロトコルは補足資料1の3ページにあり、投与中に観察された発作は補足資料1の4〜5ページに記録されます。 取り扱い誘発発作の発作モニタリングこの手順は、治療を知らされていない実験者が実行してください。すべてのケージをベンチに持ってきます。明期に毎日2回発作がないか動物を観察します。 修正されたラシーンスケールで発作活動をスコアリングします23:0 =行動の変化なし、1 =口と顔の動き、2 =頭のうなずき、3 =片側前肢クローヌス、4 =飼育を伴う両側前肢クローヌス、5 =姿勢の緊張の喪失を伴う全身性強直間代性活動、時にはジャンプ、6 =長期にわたる過度のジャンプと多動。発作の数と強度を報告します。 ケージ上でペンをスライドさせて音を立てます。 各動物を別の箱に移して戻します。 ケージを前後にゆっくりと振って、ケージの側面や上部に動物がぶつかって怪我をする危険があるほど激しくケージを振らないように注意してください。 ケージ内のすべての動物の発作を監視します。いつでも、マウスに発作がある場合は、それをホームケージに戻し、ノイズや取り扱いによる発作刺激なしに発作のレベルを書き留めます。 自発的に、またはケージを穏やかに振った後につかまっていない動物の場合、より激しい取り扱いによって発作を引き起こします:マウスの尾を左から右にひっくり返して慎重に裏返します。注:発作のある動物は興奮過敏であり、びくびくする可能性があります。 発作行動について各動物をもう一度観察します。後続のケージについてもこのプロセスを繰り返します。注:発作モニタリングの例示的なプロトコルは、 補足資料1、6〜7ページにあります。 複合効果に関するデータレポート反復測定(RM)ANOVAを使用して毎日の体重を分析します。 毎日の累積発作負荷値を使用して、データをグラフィカルに表示します。有効性データ(ラシーンステージ3〜5発作のない動物の数)を、保護された数/それぞれのグループでテストされた数(通常N = 20)として提示します。.したがって、フィッシャーの正確確率検定を使用して、反応(押収または非押収)について、車両で治療されたグループと薬物で処理されたグループ間のデータを比較します。注:ステージ2以下の発作があり、保護されていない動物がステージ3〜5の発作を起こしている場合、動物は発作から「保護されている」と見なされます。 同様に、行動障害または毒性作用のある動物の数/各グループでテストされた数と同様に忍容性データを分析します。.死亡を含む悪影響に注意してください。 ビヒクルを注射したマウスの50%未満が急性につかむ場合は、データを考慮しないでください。