Un modello per l'epilessia di eziologia infettiva utilizzando il virus dell'encefalomielite murina di Theiler
Summary
L’infezione intracerebrale con il virus dell’encefalomielite murina di Theiler (TMEV) nei topi C57BL/6 replica molti dei sintomi clinici precoci e cronici dell’encefalite virale e della successiva epilessia nei pazienti umani. Questo articolo descrive l’infezione virale, i sintomi e l’istopatologia del modello TMEV.
Abstract
Una delle principali cause di epilessia è un’infezione del sistema nervoso centrale (SNC); Circa l’8% dei pazienti che sopravvivono a tale infezione sviluppano l’epilessia come conseguenza, con tassi significativamente più alti nei paesi economicamente meno sviluppati. Questo lavoro fornisce una panoramica della modellizzazione dell’epilessia dell’eziologia infettiva e del suo utilizzo come piattaforma per nuovi test di composti antiepilettici. Viene presentato un protocollo di induzione dell’epilessia mediante iniezione intracerebrale non stereotassica del virus dell’encefalomielite murina di Theiler (TMEV) nei topi C57BL/6, che replica molti dei sintomi clinici precoci e cronici dell’encefalite virale e della successiva epilessia nei pazienti umani. Viene descritta la valutazione clinica dei topi durante l’encefalite per monitorare l’attività convulsiva e rilevare i potenziali effetti anticonvulsivi di nuovi composti. Inoltre, vengono mostrate le conseguenze istopatologiche dell’encefalite virale e delle convulsioni come il danno ippocampale e la neuroinfiammazione, nonché le conseguenze a lungo termine come le crisi epilettiche spontanee. Il modello TMEV è una delle prime piattaforme sperimentali traslazionali, guidate dall’infezione, per consentire lo studio dei meccanismi di sviluppo dell’epilessia come conseguenza dell’infezione del SNC. Pertanto, serve anche a identificare potenziali bersagli terapeutici e composti per i pazienti a rischio di sviluppare l’epilessia a seguito di un’infezione del SNC.
Introduction
Una delle frequenti conseguenze dell’encefalite virale sono le crisi epilettiche. Molte infezioni virali scatenano convulsioni sintomatiche durante la fase acuta dell’infezione; Il rischio di tali sequestri è aumentato di oltre il 20% tra la popolazione in generale 1,2,3. I pazienti che sopravvivono all’infezione hanno anche un aumentato rischio del 4% -20% di sviluppare epilessia cronica nei mesi o anni dopo l’infezione 1,4. Il virus dell’encefalomielite murina di Theiler (TMEV) è stato identificato come un virus adatto per studiare le crisi acute e croniche in un modello murino di encefalite virale 5,6,7. TMEV è un virus RNA a singolo filamento non avvolto, a senso positivo, della famiglia Picornaviridae ed è stato tradizionalmente utilizzato per studiare la demielinizzazione nel midollo spinale dei topi SJL, da cui i topi C57BL / 6 (B6) sono protetti perché hanno la capacità di eliminare rapidamente il virus dopo l’infezione. Tuttavia, TMEV induce crisi acute nel 50%-75% dei topi B6 maschi e femmine entro la prima settimana dopo l’infezione (pi), mentre circa il 25%-40% sviluppa epilessia cronica settimane o mesi pi 2,5,6,8,9. Oltre alle convulsioni, i topi mostrano anche l’istopatologia comune di un ippocampo epilettico con neurodegenerazione e gliosi 5,6,8,10,11,12. Inoltre, i topi B6 infetti da TMEV hanno prestazioni significativamente peggiori nei test comportamentali per l’apprendimento e la memoria e hanno una comorbidità cognitiva, che si osserva anche nei pazienti clinici con epilessia13,14,15.
Tradizionalmente, i modelli di epilessia e convulsioni utilizzano l’applicazione di sostanze chemioconvulsive o la stimolazione elettrica per indurre convulsioni; Tuttavia, questi modelli mancano di validità costruttiva e spesso mostrano convulsioni più gravi e danni cerebrali rispetto a quelli osservati nei pazienti clinici16. Non esiste un modello appropriato per ogni domanda di ricerca17. L’uso del modello TMEV è particolarmente interessante se vengono studiati i fattori predisponenti dello sviluppo delle crisi dopo un’infezione del SNC o se i composti vengono sottoposti a screening per la loro efficacia anticonvulsiva.
Poiché il modello TMEV è stato stabilito e utilizzato in diversi laboratori a livello internazionale, gli autori hanno identificato molti dettagli che consentono un’implementazione di successo del modello, ad esempio la specificità di diversi ceppi di virus e topi. L’induzione convulsiva più affidabile è stata generata con il ceppo di Daniel di topi TMEV e B6J 2,5,6,8,9. Il modello è attualmente utilizzato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) come piattaforma per identificare nuovi farmaci contro l’epilessia e le convulsioni18,19. Questo documento include il protocollo dettagliato di induzione del virus e monitoraggio clinico per consentire ad altri ricercatori di utilizzare questo modello di encefalite virale per approfondire la comprensione dei meccanismi della malattia, nonché per i test farmacologici.
Il seguente protocollo riflette uno studio progettato per i test composti in questo modello, sebbene possano essere eseguiti numerosi altri tipi di studi. I topi vengono anestetizzati brevemente prima dell’iniezione con il ceppo di TMEV di Daniel nella regione temporale dell’emisfero destro (posteriore e mediale all’occhio destro). A seconda della domanda di ricerca, se sono necessari animali di controllo non infetti, i topi ricevono soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, inclusi KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] e Na 2 HPO4·7H 2 O [2,97mM]) invece di TMEV. Precedenti esperienze in topi infetti da TMEV hanno indicato che le convulsioni indotte dalla manipolazione si verificano tra il giorno 3 e il giorno 7 dopo l’infezione. La frequenza dell’iniezione, la via e il tempo di prova dei composti sperimentali variano a seconda delle loro proprietà. Si raccomanda di eseguire l’inoculazione del virus il venerdì, il che consente il monitoraggio delle crisi epilettiche del giorno 3-7 la settimana successiva, dal lunedì al venerdì. Durante la settimana di monitoraggio delle crisi, i composti sperimentali possono essere somministrati (i.p.) due volte al giorno (almeno 4 ore di distanza) se non diversamente suggerito dalla cinetica o dal meccanismo d’azione del composto. Il monitoraggio delle crisi durante il trattamento può essere eseguito in un momento precedentemente determinato. I tempi di iniezione e osservazione variano a seconda dei singoli composti. Gli animali vengono iniettati con il composto in esame o con un veicolo al posto del composto farmacologico. Questi due gruppi possono essere gestiti e osservati analogamente al gruppo sperimentale. Durante l’esperimento, l’unica persona che maneggia i topi e segna le convulsioni dovrebbe essere cieca al trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo è il primo modello di roditore basato sull’infezione per l’epilessia che consente di indagare sullo sviluppo delle crisi acute e croniche. Aiuterà a identificare bersagli farmacologici e nuovi composti per la prevenzione o la modifica delle malattie per una delle eziologie più comuni dell’epilessia.
Come descritto sopra, può essere necessaria un’attenta considerazione del lotto e del titolo virale per garantire che un’adeguata percentuale di topi trattati con TMEV dimostri convulsioni indotte dalla manipolazione. Se gli animali hanno meno convulsioni del solito, utilizzare un lotto di N = 20 animali per verificare l’efficacia del virus. Se la sua attività è diminuita (meno del 50%), è il momento di fare nuove aliquote e testarle con N = 20 animali. Se le nuove aliquote non sono più efficienti, è necessario purificare un nuovo lotto del virus. Per alcune linee di topi transgenici, potrebbe essere necessario utilizzare un titolo virale inferiore; Pertanto, il titolo virale deve essere diluito secondo necessità dopo esperimenti preliminari. La maggior parte dei dati disponibili sui topi B6 proviene dai Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA o Charles River, Sulzfeld, Germania); tuttavia, tassi di crisi simili nei topi B6 ottenuti da Harlan (Eystrup, Germania) sono stati confermati8. I tassi di sequestro di animali transgenici con un background B6 sono paragonabili ai topi B6 selvatici, ma potrebbero differire se i cambiamenti genetici hanno un’influenza sull’invasione del virus, sulla risposta infiammatoria o sulla neurodegenerazione21. Le convulsioni acute sono osservate spontaneamente ma innescate dalla manipolazione e dal rumore, quindi è della massima importanza gestire tutti gli animali in modo simile quando si confrontano i tassi di crisi. Le sessioni di manipolazione due volte al giorno hanno precedentemente fornito un elevato carico convulsivo e una percentuale maggiore di topi che hanno dimostrato convulsioni durante i giorni 3-7 dopo l’infezione 6,8,19. Ulteriori sessioni di manipolazione (giorno 1 e giorno 2) possono anche essere impiegate per aumentare il carico convulsivo. Inoltre, gli animali possono essere osservati prima di ogni sessione di manipolazione per garantire che non si verifichino convulsioni spontanee. Un ambiente di laboratorio rumoroso, ad esempio, può produrre convulsioni, che possono, a loro volta, rendere gli animali refrattari alle convulsioni indotte dalla manipolazione durante i periodi di prova.
Mentre l’infezione da TMEV produce convulsioni indotte dalla manipolazione nella maggior parte dei topi, non è noto il motivo per cui alcuni animali sono resistenti a questo trattamento. Come descritto sopra, può essere che si verifichino convulsioni elettrografiche (con comportamenti minimi o assenti) e non siano normalmente quantificate senza registrazione EEG concomitante. Può anche essere che piccole differenze nella posizione di iniezione facilitino la riduzione dell’effetto virale nel cervello; Tuttavia, sono state riportate convulsioni dopo infezione corticale e striatale 5,6,8,9 a causa del tropismo del virus all’ippocampo. Per gli studi di screening farmacologico in questo modello, per identificare una riduzione delle convulsioni (ad esempio, una riduzione del 50% del carico convulsivo), è necessario un numero maggiore di animali per ciascun gruppo (ad esempio, N = 20). Inoltre, la variabilità nei comportamenti convulsivi in questo modello richiede maggiori differenze negli effetti del farmaco rispetto al veicolo per identificare una significativa riduzione delle crisi. Pertanto, una limitazione di questo modello è il requisito di gruppi di dimensioni maggiori. Tuttavia, dimensioni sufficienti del gruppo consentono anche l’identificazione di effetti anti-sequestro e anti-infiammatori in questo modello19.
La stragrande maggioranza delle crisi osservabili in questo modello si verifica durante il periodo di infezione acuta. Nonostante l’insorgenza di degenerazione ippocampale, attivazione delle cellule immunitarie e deficit cognitivi osservati nei topi trattati con TMEV, solo una piccola parte degli animali trattati alla fine sviluppa convulsioni croniche spontanee. Questo basso carico convulsivo complessivo richiederebbe un gran numero di topi infetti per studiare adeguatamente le crisi spontanee in questo modello, che va oltre la portata e la capacità di molti progetti. L’impianto di elettrodi profondi e il monitoraggio EEG aumenterebbero anche il carico sugli animali da esperimento. Mentre gli elettrodi di profondità possono aiutare nell’identificazione dell’attività convulsiva spontanea, i cambiamenti nell’anatomia dell’ippocampo dopo l’infezione possono rendere difficile il posizionamento coerente degli elettrodi.
L’urgente necessità di identificare nuovi trattamenti per l’epilessia richiede lo sviluppo di modelli che possano essere utilizzati come metodo di screening rapido per l’efficacia antiepilettica. Questo modello fornisce funzionalità per soddisfare questa richiesta urgente. Inoltre, il fatto che non richieda alcun intervento chirurgico stereotassico lo rende un modello adatto e facile da eseguire per lo studio dei composti antiepilettici.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SB è supportato da una sovvenzione iniziale del FU Berlin. KSW è supportato da R37 NS065434 e dalla Fondazione ALSAM. LAB è supportato da un premio D-SPAN 1F99NS125773-01. Ringraziamo Robert Fujinami, Ph.D. per averci fornito il virus Theiler e la University of Utah Cell Imaging Core Facility per il supporto alla microscopia.
Materials
| Absorbent paper | – | – | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | – | – | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
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