מודל לאפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית באמצעות וירוס Murine Encephalomyelitis של Theiler
Summary
זיהום תוך-מוחי בנגיף האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) בעכברי C57BL/6 משכפל רבים מהתסמינים הקליניים המוקדמים והכרוניים של דלקת המוח הנגיפית ואפילפסיה שלאחר מכן בחולים אנושיים. מאמר זה מתאר את זיהום הנגיף, הסימפטומים וההיסטופתולוגיה של מודל TMEV.
Abstract
אחד הגורמים העיקריים לאפילפסיה הוא זיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS); כ-8% מהחולים ששורדים זיהום כזה מפתחים אפילפסיה כתוצאה מכך, כאשר השיעורים גבוהים משמעותית במדינות פחות מפותחות כלכלית. עבודה זו מספקת סקירה כללית של מידול אפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית ושימוש בה כפלטפורמה לבדיקות מורכבות אנטי-פרכוסיות חדשניות. מוצג פרוטוקול של השראת אפילפסיה על ידי הזרקה תוך-מוחית לא סטריאוטקטית של וירוס האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) של טיילר בעכברי C57BL/6, אשר משכפל רבים מהתסמינים הקליניים המוקדמים והכרוניים של דלקת המוח הנגיפית ואפילפסיה עוקבת בחולים אנושיים. מתוארת הערכה קלינית של עכברים במהלך דלקת המוח כדי לעקוב אחר פעילות ההתקפים ולזהות את ההשפעות האנטי-פרכוסיות האפשריות של תרכובות חדשות. יתר על כן, מוצגות השלכות היסטופתולוגיות של דלקת מוח נגיפית ופרכוסים כגון נזק להיפוקמפוס ודלקת עצבית, כמו גם השלכות ארוכות טווח כגון התקפים אפילפטיים ספונטניים. מודל TMEV הוא אחת הפלטפורמות הניסיוניות הראשונות המאפשרות לחקור את מנגנוני התפתחות האפילפסיה כתוצאה מזיהום במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, הוא משמש גם לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ותרכובות עבור חולים בסיכון לפתח אפילפסיה בעקבות זיהום CNS.
Introduction
אחת התוצאות השכיחות של דלקת המוח הנגיפית היא התקפים אפילפטיים. זיהומים ויראליים רבים מעוררים התקפים סימפטומטיים במהלך השלב החריף של הזיהום; הסיכון להתקפים כאלה גדל ביותר מ-20% בקרב הציבור הרחב 1,2,3. חולים ששורדים את הזיהום נמצאים גם בסיכון מוגבר של 4%-20% לפתח אפילפסיה כרונית בחודשים עד שנים לאחר ההדבקה 1,4. נגיף האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) זוהה כנגיף מתאים לחקר התקפים חריפים וכרוניים במודל עכברי של דלקת מוח ויראלית 5,6,7. TMEV הוא נגיף RNA חד-גדילי לא עטוף, בעל חוש חיובי וחד-גדילי ממשפחת Picornaviridae, ובאופן מסורתי שימש לחקר דה-מיאלינציה בחוט השדרה של עכברי SJL, שעכברי C57BL/6 (B6) מוגנים מפניו מכיוון שיש להם את היכולת לנקות את הנגיף במהירות לאחר ההדבקה. עם זאת, TMEV גורם להתקפים חריפים אצל 50%-75% מעכברי B6 זכרים ונקבות בשבוע הראשון לאחר ההדבקה (pi), בעוד שכ -25%-40% מפתחים אפילפסיה כרונית שבועות עד חודשים pi 2,5,6,8,9. מלבד התקפים, העכברים מציגים גם את ההיסטופתולוגיה הנפוצה של היפוקמפוס אפילפטי עם ניוון עצבי וגליוזיס 5,6,8,10,11,12. יתר על כן, עכברי B6 נגועים ב- TMEV מתפקדים גרוע משמעותית במבחנים התנהגותיים ללמידה וזיכרון ויש להם תחלואה נלווית קוגניטיבית, אשר נראית גם בחולים קליניים עם אפילפסיה13,14,15.
באופן מסורתי, מודלים של אפילפסיה והתקפים משתמשים ביישום של חומרים כימו-פרכוסיים או בגירוי חשמלי כדי לגרום להתקפים; עם זאת, מודלים אלה חסרים תוקף מבני ולעתים קרובות מציגים התקפים חמורים יותר ונזק מוחי מאשר נראים בחולים קליניים16. אין מודל שמתאים לכל שאלת מחקר17. השימוש במודל TMEV מעניין במיוחד אם הגורמים המקדימים להתפתחות התקפים לאחר זיהום במערכת העצבים המרכזית נחקרים או אם תרכובות נבדקות ליעילותן נגד פרכוסים.
מאז שמודל TMEV הוקם ונעשה בו שימוש במספר מעבדות שונות ברחבי העולם, המחברים זיהו פרטים רבים המאפשרים יישום מוצלח של המודל, למשל, הספציפיות של זני וירוסים ועכברים שונים. השראת ההתקפים האמינה ביותר נוצרה עם זן דניאל של עכברי TMEV ו-B6J 2,5,6,8,9. המודל משמש כיום את המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) כפלטפורמה לזיהוי תרופות חדשות נגד אפילפסיה והתקפים18,19. מאמר זה כולל את הפרוטוקול המפורט של השראת וירוסים וניטור קליני כדי לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במודל זה של דלקת המוח הנגיפית כדי לקדם את ההבנה של מנגנוני המחלה, כמו גם לבדיקות סמים.
הפרוטוקול הבא משקף מחקר המיועד לבדיקות מורכבות במודל זה, אם כי ניתן לבצע סוגים רבים אחרים של מחקרים. עכברים מורדמים זמן קצר לפני הזרקה עם זן דניאל של TMEV באזור הרקתי של ההמיספרה הימנית (אחורית ומדיאלית לעין ימין). בהתאם לשאלת המחקר, אם יש צורך בחיות ביקורת שאינן נגועות, עכברים מקבלים מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4, כולל KH 2 PO 4 [1.06 mM], NaCl [155.17 mM] ו-Na 2 HPO4·7H 2 O [2.97mM]) במקום TMEV. ניסיון קודם בעכברים נגועים ב-TMEV הצביע על כך שהתקפים הנגרמים על ידי טיפול מתרחשים בין היום השלישי ליום השביעי לאחר ההדבקה. תדירות ההזרקה, המסלול וזמן הבדיקה של תרכובות הניסוי משתנים בהתאם לתכונותיהן. מומלץ לבצע את החיסון נגד הנגיף ביום שישי, המאפשר מעקב אחר התקפים ביום 3-7 בשבוע שלאחר מכן, בימים שני עד שישי. במהלך שבוע ניטור ההתקפים, ניתן לתת תרכובות ניסיוניות (כלומר) פעמיים ביום (בהפרש של לפחות 4 שעות), אלא אם כן הוצע אחרת על ידי הקינטיקה או מנגנון הפעולה של התרכובת. ניטור התקפים במהלך הטיפול יכול להתבצע בנקודת זמן שנקבעה מראש. זמני ההזרקה וההסתכלות משתנים בהתאם לתרכובות הבודדות. לבעלי חיים מוזרקים תרכובת הבדיקה או רכב במקום תרכובת הסמים. ניתן לטפל בשתי קבוצות אלה ולצפות בהן באופן מקביל לקבוצת הניסוי. במהלך הניסוי, האדם היחיד המטפל בעכברים ומבקיע את ההתקפים צריך להיות עיוור לטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
זהו מודל המכרסמים מבוסס הזיהום הראשון לאפילפסיה המאפשר חקירה של התפתחות התקפים חריפה וכרונית. זה יעזור לזהות מטרות סמים ותרכובות חדשות למניעת מחלות או שינוי עבור אחת האטיולוגיות הנפוצות ביותר של אפילפסיה.
כפי שתואר לעיל, ייתכן שיהיה צורך לשקול בזהירות את האצווה ואת הטיטר הנגיפי כדי להבטיח ששיעור הולם של עכברים שטופלו ב-TMEV יפגינו התקפים הנגרמים על ידי טיפול. אם לבעלי חיים יש פחות התקפים מהרגיל, השתמש בקבוצה של N = 20 בעלי חיים כדי לאמת את יעילות הנגיף. אם פעילותו מופחתת (פחות מ -50%), הגיע הזמן לעשות aliquots חדשים ולבדוק אותם עם N = 20 בעלי חיים. אם aliquots החדש אינם יעילים יותר, אצווה חדשה של הנגיף צריך להיות מטוהר. עבור כמה קווי עכבר מהונדס, ייתכן שיהיה צורך להשתמש titer ויראלי נמוך יותר; לכן, יש לדלל את הטיטר הנגיפי לפי הצורך לאחר ניסויים מקדימים. רוב הנתונים הזמינים על עכברי B6 מקורם במעבדות ג’קסון (בר הרבור, ME, ארה”ב או נהר צ’ארלס, זולצפלד, גרמניה); עם זאת, שיעורי התקפים דומים בעכברי B6 שהתקבלו מהרלן (Eystrup, גרמניה) אושרו8. שיעורי ההתקפים של בעלי חיים טרנסגניים עם רקע B6 דומים לעכברי B6 פראיים, אך עשויים להיות שונים אם לשינויים הגנטיים יש השפעה על פלישת וירוסים, תגובה דלקתית או ניוון עצבי21. התקפים חריפים נצפים באופן ספונטני אך מופעלים על ידי טיפול ורעש, ולכן יש חשיבות עליונה לטפל בכל בעלי החיים באופן דומה כאשר משווים את שיעורי ההתקפים. מפגשי טיפול פעמיים ביום סיפקו בעבר נטל התקפים גבוה ושיעור גבוה יותר של עכברים שהפגינו התקפים בימים 3-7 לאחר ההדבקה 6,8,19. ניתן להשתמש גם במפגשי טיפול נוספים (יום 1 ויום 2) כדי להגביר את נטל התפיסה. יתר על כן, ניתן לצפות בבעלי חיים לפני כל מפגש טיפול כדי להבטיח שהתקפים ספונטניים אינם מתרחשים. סביבת מעבדה רועשת, למשל, עלולה לייצר התקפים, אשר עשויים, בתורם, להפוך בעלי חיים עמידים לטיפול בהתקפים הנגרמים במהלך זמני הבדיקה.
בעוד שזיהום TMEV גורם להתקפים הנגרמים על ידי טיפול ברוב העכברים, לא ידוע מדוע בעלי חיים מסוימים עמידים לטיפול זה. כפי שתואר לעיל, ייתכן כי התקפים אלקטרוגרפיים (עם התנהגויות מינימליות או ללא התנהגויות הקשורות) מתרחשים ואינם מכומתים בדרך כלל ללא רישום EEG במקביל. ייתכן גם כי הבדלים קטנים במיקום ההזרקה להקל על השפעה ויראלית מופחתת במוח; עם זאת, התקפים דווחו לאחר זיהום קליפת המוח והסטריאטלי 5,6,8,9 עקב טרופיזם של הנגיף להיפוקמפוס. עבור מחקרי סינון תרופות במודל זה, כדי לזהות הפחתה בהתקפים (למשל, הפחתה של 50% בנטל ההתקפים), נדרש מספר גדול יותר של בעלי חיים עבור כל קבוצה (למשל, N = 20). יתר על כן, השונות בהתנהגויות ההתקפים במודל זה מחייבת הבדלים גדולים יותר בהשפעות סמים לעומת כלי רכב כדי לזהות הפחתה משמעותית בפרכוסים. לכן, מגבלה אחת של מודל זה היא הדרישה לגודל קבוצה גדול יותר. עם זאת, גודל קבוצה מספיק מאפשר גם זיהוי של השפעות נוגדות פרכוסים ואנטי דלקתיות במודל זה19.
הרוב המכריע של ההתקפים הנצפים במודל זה מתרחשים במהלך תקופת הזיהום החריף. למרות התרחשות של ניוון ההיפוקמפוס, הפעלת תאי מערכת החיסון וליקויים קוגניטיביים שנצפו בעכברים שטופלו ב-TMEV, רק חלק קטן מבעלי החיים שטופלו מפתחים בסופו של דבר התקפים כרוניים וספונטניים. נטל ההתקפים הכולל הנמוך הזה ידרוש מספר רב של עכברים נגועים על מנת לחקור כראוי התקפים ספונטניים במודל זה, שהוא מעבר להיקפם וליכולתם של פרויקטים רבים. השתלת אלקטרודות עומק וניטור EEG יגבירו גם הם את העומס על חיות הניסוי. בעוד אלקטרודות עומק עשויות לסייע בזיהוי פעילות התקפים ספונטנית, שינויים באנטומיה של ההיפוקמפוס בעקבות זיהום עשויים להפוך את מיקום האלקטרודות העקבי לאתגר.
הצורך הדחוף בזיהוי טיפולים חדשים לאפילפסיה מחייב פיתוח מודלים שיוכלו לשמש כשיטת סינון מהירה ליעילות נוגדת פרכוסים. מודל זה מספק תכונות לטיפול בבקשה דחופה זו. יתר על כן, העובדה שהוא אינו דורש כל ניתוח סטריאוטקטי הופכת אותו למודל מתאים וקל לביצוע לחקירת תרכובות נוגדות פרכוסים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SB נתמך על ידי מענק התחלתי של FU ברלין. KSW נתמך על ידי R37 NS065434 וקרן ALSAM. LAB נתמך על ידי פרס D-SPAN 1F99NS125773-01. אנו מודים לרוברט פוג’ינמי, Ph.D. על שסיפק לנו את נגיף טיילר ואת מתקן הליבה להדמיית תאים באוניברסיטת יוטה לתמיכה במיקרוסקופיה.
Materials
| Absorbent paper | – | – | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | – | – | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, 13-18 (2008).
- Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler’s virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler’s virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler’s virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler’s murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
