نموذج لصرع المسببات المعدية باستخدام فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران ثيلر
Summary
تكرر العدوى داخل المخ بفيروس التهاب الدماغ والنخاع في الثيلين (TMEV) في الفئران C57BL / 6 العديد من الأعراض السريرية المبكرة والمزمنة لالتهاب الدماغ الفيروسي والصرع اللاحق في المرضى من البشر. تصف هذه الورقة عدوى الفيروس والأعراض وعلم أمراض الأنسجة لنموذج TMEV.
Abstract
أحد الأسباب الرئيسية للصرع هو عدوى الجهاز العصبي المركزي (CNS). ما يقرب من 8 ٪ من المرضى الذين نجوا من مثل هذه العدوى يصابون بالصرع نتيجة لذلك ، مع ارتفاع المعدلات بشكل ملحوظ في البلدان الأقل تقدما من الناحية الاقتصادية. يقدم هذا العمل لمحة عامة عن نمذجة الصرع من المسببات المعدية واستخدامه كمنصة لاختبار مركب مضاد للتشنج الجديد. يتم تقديم بروتوكول لتحريض الصرع عن طريق الحقن داخل المخ غير التجسيمي لفيروس التهاب الدماغ والنخاع في الفئران (TMEV) في الفئران C57BL / 6 ، والذي يكرر العديد من الأعراض السريرية المبكرة والمزمنة لالتهاب الدماغ الفيروسي والصرع اللاحق في المرضى من البشر. تم وصف التقييم السريري للفئران أثناء التهاب الدماغ لمراقبة نشاط النوبات والكشف عن الآثار المحتملة المضادة للنوبات للمركبات الجديدة. علاوة على ذلك ، تظهر العواقب النسيجية المرضية لالتهاب الدماغ الفيروسي والنوبات مثل تلف الحصين والتهاب الأعصاب ، وكذلك العواقب طويلة المدى مثل نوبات الصرع التلقائية. يعد نموذج TMEV أحد المنصات التجريبية الأولى التي تعتمد على العدوى للسماح بالتحقيق في آليات تطور الصرع نتيجة لعدوى الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإنه يعمل أيضا على تحديد الأهداف والمركبات العلاجية المحتملة للمرضى المعرضين لخطر الإصابة بالصرع بعد عدوى الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
واحدة من العواقب المتكررة لالتهاب الدماغ الفيروسي هي نوبات الصرع. تؤدي العديد من الالتهابات الفيروسية إلى نوبات أعراض خلال المرحلة الحادة من العدوى. يزداد خطر حدوث مثل هذه النوبات بأكثر من 20٪ بين عامة الناس1،2،3. المرضى الذين نجوا من العدوى لديهم أيضا خطر متزايد بنسبة 4٪ -20٪ من الإصابة بالصرع المزمن في الأشهر إلى السنوات التالية للعدوى 1,4. تم تحديد فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر في ثيلر (TMEV) كفيروس مناسب لدراسة النوبات الحادة والمزمنة في نموذج فأر من التهاب الدماغ الفيروسي5،6،7. TMEV هو فيروس RNA غير مغلف ، ذو إحساس إيجابي ، أحادي الشريط من عائلة Picornaviridae وقد استخدم تقليديا لدراسة إزالة الميالين في الحبل الشوكي لفئران SJL ، والتي تحمي الفئران C57BL / 6 (B6) لأن لديها القدرة على إزالة الفيروس بسرعة بعد الإصابة. ومع ذلك ، فإن TMEV يحفز نوبات حادة في 50٪ -75٪ من ذكور وإناث الفئران B6 خلال الأسبوع الأول بعد الإصابة (pi) ، بينما يصاب حوالي 25٪ -40٪ بالصرع المزمن من أسابيع إلى أشهرpi 2،5،6،8،9. بصرف النظر عن النوبات ، تظهر الفئران أيضا التشريح المرضي الشائع لقرن آمون الصرع مع التنكس العصبي والتسمم5،6،8،10،11،12. علاوة على ذلك ، فإن أداء الفئران B6 المصابة ب TMEV أسوأ بكثير في الاختبارات السلوكية للتعلم والذاكرة ولديها اعتلال مشترك معرفي ، والذي يظهر أيضا في المرضى السريريين المصابين بالصرع13،14،15.
تقليديا ، تستخدم نماذج الصرع والنوبات إما تطبيق المواد الكيميائية المتشنجة أو التحفيز الكهربائي للحث على النوبات. ومع ذلك ، تفتقر هذه النماذج إلى صلاحية البناء وغالبا ما تظهر نوبات شديدة وتلف في الدماغ أكثر مما يظهر في المرضى السريريين16. لا يوجد نموذج مناسب لكل سؤال بحثي17. يعد استخدام نموذج TMEV مثيرا للاهتمام بشكل خاص إذا تم البحث عن العوامل المؤهبة لتطور النوبات بعد الإصابة بالجهاز العصبي المركزي أو إذا تم فحص المركبات للتأكد من كفاءتها المضادة للتشنج.
منذ أن تم إنشاء نموذج TMEV واستخدامه عبر العديد من المختبرات المختلفة على المستوى الدولي ، حدد المؤلفون العديد من التفاصيل التي تسمح بالتنفيذ الناجح للنموذج ، على سبيل المثال ، خصوصية سلالات الفيروسات والفئران المختلفة. تم إنشاء تحريض النوبات الأكثر موثوقية مع سلالة دانيال من الفئران TMEV و B6J2،5،6،8،9. يستخدم النموذج حاليا من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) كمنصة لتحديد الأدوية الجديدة ضد الصرع والنوبات18,19. تتضمن هذه الورقة البروتوكول التفصيلي لتحريض الفيروس والمراقبة السريرية للسماح للباحثين الآخرين باستخدام هذا النموذج من التهاب الدماغ الفيروسي لتعزيز فهم آليات المرض ، وكذلك لاختبار الأدوية.
يعكس البروتوكول التالي دراسة مصممة لاختبار المركب في هذا النموذج ، على الرغم من أنه يمكن إجراء العديد من أنواع الدراسات الأخرى. يتم تخدير الفئران لفترة وجيزة قبل الحقن بسلالة دانيال من TMEV في المنطقة الزمنية لنصف الكرة الأيمن (الخلفي والإنسي للعين اليمنى). اعتمادا على سؤال البحث ، إذا كانت هناك حاجة إلى مراقبة غير مصابة ، تتلقى الفئران محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، بما في ذلك KH 2 PO 4 [1.06 mM] ، NaCl [155.17 mM] ، و Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2.97mM]) بدلا من TMEV. أشارت التجربة السابقة في الفئران المصابة ب TMEV إلى أن النوبات التي يسببها التعامل تحدث بين اليوم 3 واليوم 7 بعد الإصابة. يختلف تواتر الحقن ومسار ووقت اختبار المركبات التجريبية وفقا لخصائصها. يوصى بإجراء التطعيم ضد الفيروس يوم الجمعة ، مما يسمح بمراقبة النوبات في اليوم 3-7 في الأسبوع التالي ، من الاثنين إلى الجمعة. خلال أسبوع مراقبة النوبات ، يمكن إعطاء المركبات التجريبية (i.p.) مرتين يوميا (على الأقل 4 ساعات) ما لم تقترح حركية المركب أو آلية العمل خلاف ذلك. يمكن إجراء مراقبة النوبات أثناء العلاج في نقطة زمنية محددة مسبقا. تختلف أوقات الحقن والمراقبة اعتمادا على المركبات الفردية. يتم حقن الحيوانات بمركب الاختبار أو بمركبة بدلا من مركب الدواء. يمكن التعامل مع هاتين المجموعتين وملاحظتهما بشكل مشابه للمجموعة التجريبية. أثناء التجربة ، يجب أن يعمى الشخص الوحيد الذي يتعامل مع الفئران ويسجل النوبات عن العلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا هو أول نموذج للقوارض القائم على العدوى للصرع الذي يسمح بالتحقيق في تطور النوبات الحادة والمزمنة. وسوف يساعد على تحديد أهداف الأدوية والمركبات الجديدة للوقاية من الأمراض أو تعديلها لأحد مسببات الصرع الأكثر شيوعا.
كما هو موضح أعلاه ، قد يكون من الضروري النظر بعناية في الدفعة والعيار الفيروسي لضمان أن تظهر نسبة كافية من الفئران المعالجة TMEV نوبات ناجمة عن المناولة. إذا كانت الحيوانات تعاني من نوبات أقل من المعتاد ، فاستخدم مجموعة من N = 20 حيوانا للتحقق من كفاءة الفيروس. إذا انخفض نشاطها (أقل من 50٪) ، فقد حان الوقت لعمل حصص جديدة واختبارها باستخدام N = 20 حيوانا. إذا لم تكن الحصص الجديدة أكثر كفاءة ، فيجب تنقية دفعة جديدة من الفيروس. بالنسبة لبعض خطوط الماوس المعدلة وراثيا ، قد يكون من الضروري استخدام عيار فيروسي أقل ؛ لذلك ، يجب تخفيف العيار الفيروسي حسب الحاجة بعد التجارب الأولية. معظم البيانات المتاحة عن الفئران B6 نشأت من مختبرات جاكسون (بار هاربور ، الشرق الأوسط ، الولايات المتحدة الأمريكية أو تشارلز ريفر ، سولزفيلد ، ألمانيا). ومع ذلك ، تم تأكيد معدلات نوبات مماثلة في الفئران B6 التي تم الحصول عليها من Harlan (Eystrup ، ألمانيا)8. معدلات المضبوطات للحيوانات المعدلة وراثيا ذات الخلفية B6 قابلة للمقارنة مع الفئران B6 من النوع البري ولكن يمكن أن تختلف إذا كان للتغيرات الجينية تأثير على غزو الفيروس أو الاستجابة الالتهابية أو التنكس العصبي21. يتم ملاحظة النوبات الحادة تلقائيا ولكن يتم تشغيلها عن طريق المناولة والضوضاء ، لذلك من الأهمية بمكان التعامل مع جميع الحيوانات بطريقة مماثلة عند مقارنة معدلات النوبات. قدمت جلسات المناولة مرتين يوميا في السابق عبئا كبيرا من النوبات ونسبة أكبر من الفئران التي تظهر نوبات خلال الأيام 3-7 بعد الإصابة6،8،19. يمكن أيضا استخدام جلسات مناولة إضافية (اليوم 1 واليوم 2) لزيادة عبء النوبات. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة الحيوانات قبل كل جلسة مناولة لضمان عدم حدوث نوبات عفوية. على سبيل المثال ، قد تنتج بيئة المختبر الصاخبة نوبات ، والتي بدورها قد تجعل الحيوانات مقاومة للنوبات التي يسببها التعامل معها خلال أوقات الاختبار.
في حين أن عدوى TMEV تنتج نوبات ناجمة عن المناولة في غالبية الفئران ، فمن غير المعروف سبب مقاومة بعض الحيوانات لهذا العلاج. كما هو موضح أعلاه ، قد تحدث نوبات كهربية (مع الحد الأدنى من السلوكيات المرتبطة بها أو بدونها) ولا يتم قياسها عادة دون تسجيل EEG المصاحب. قد يكون أيضا أن الاختلافات الصغيرة في موقع الحقن تسهل تقليل التأثير الفيروسي في الدماغ. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن النوبات بعد العدوى القشرية والمخططة5،6،8،9 بسبب انتحاء الفيروس إلى الحصين. بالنسبة لدراسات فحص المخدرات في هذا النموذج ، لتحديد انخفاض في النوبات (على سبيل المثال ، انخفاض بنسبة 50٪ في عبء النوبات) ، يلزم وجود عدد أكبر من الحيوانات لكل مجموعة (على سبيل المثال ، N = 20). علاوة على ذلك ، فإن التباين في سلوكيات النوبات في هذا النموذج يستلزم اختلافات أكبر في تأثيرات المخدرات مقابل المركبات لتحديد انخفاض كبير في النوبات. لذلك ، فإن أحد قيود هذا النموذج هو متطلبات أحجام المجموعات الأكبر. ومع ذلك ، فإن أحجام المجموعات الكافية تسمح أيضا بتحديد التأثيرات المضادة للنوبات والمضادة للالتهابات في هذا النموذج19.
تحدث الغالبية العظمى من النوبات التي يمكن ملاحظتها في هذا النموذج خلال فترة العدوى الحادة. على الرغم من حدوث تنكس الحصين ، وتنشيط الخلايا المناعية ، والعجز المعرفي الذي لوحظ في الفئران التي عولجت ب TMEV ، فإن جزءا صغيرا فقط من الحيوانات التي عولجت تتطور في النهاية إلى نوبات مزمنة وعفوية. سيتطلب عبء النوبات الإجمالي المنخفض هذا عددا كبيرا من الفئران المصابة من أجل دراسة النوبات التلقائية بشكل صحيح في هذا النموذج ، وهو ما يتجاوز نطاق وقدرة العديد من المشاريع. كما أن زرع قطب العمق ومراقبة EEG من شأنه أيضا زيادة العبء على التجارب. في حين أن أقطاب العمق قد تساعد في تحديد نشاط النوبة التلقائية ، فإن التغييرات في تشريح الحصين بعد العدوى قد تجعل وضع القطب الكهربائي المتسق تحديا.
تتطلب الحاجة الملحة لتحديد علاجات جديدة للصرع تطوير نماذج يمكن استخدامها كطريقة فحص سريعة لفعالية مضادات النوبات. يوفر هذا النموذج ميزات لمعالجة هذا الطلب العاجل. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أنه لا يتطلب أي جراحة تجسيمية يجعله نموذجا مناسبا وسهل الأداء للتحقيق في المركبات المضادة للتشنج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم SB من خلال منحة أولية من FU Berlin. يتم دعم KSW من قبل R37 NS065434 ومؤسسة ALSAM. يتم دعم LAB بجائزة D-SPAN 1F99NS125773-01. نشكر روبرت فوجينامي ، دكتوراه لتزويدنا بفيروس ثيلر والمرفق الأساسي للتصوير الخلوي بجامعة يوتا لدعم الفحص المجهري.
Materials
| Absorbent paper | – | – | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | – | – | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, 13-18 (2008).
- Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler’s virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler’s virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler’s virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler’s murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
