発色団の存在下および非存在下におけるCu(II)とペプチド残基間の結合相互作用の定量化
Summary
この記事では、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定を使用して、ペプチドおよびタンパク質に結合するCu(II)の熱力学をプローブおよび定量することに焦点を当てます。
Abstract
銅(II)は、生体系に不可欠な金属であり、相互作用する生体分子に独自の化学的特性を与えます。様々なペプチドに直接結合し、構造の媒介から電子移動特性、触媒機能の付与に至るまで、必要かつ病理学的役割を果たすことが報告されている。これらのCu(II)-ペプチド複合体の結合親和性と熱力学を インビトロで 定量化することで、結合の熱力学的駆動力、ペプチドの異なる金属イオン間またはCu(II)の異なるペプチド間の潜在的な競合、およびCu(II)-ペプチド複合体の インビボでの有病率についての洞察が得られます。しかし、結合熱力学を定量化することは、滴定実験内のすべての競合平衡を説明することを含む無数の要因のために、特にペプチド、dブロック金属イオン、およびそれらの相互作用を表す離散的な分光ハンドルが欠落している場合には困難であり得る。
ここでは、Cu(II)-ペプチド熱力学の正確な定量化のための堅牢な一連の実験が提供されています。この記事では、Cu(II)に必要な分光ハンドルを提供するために、発色性リガンドの存在下および非存在下での電子吸収分光法の使用と、ラベルフリーの等温滴定熱量測定の使用に焦点を当てています。両方の実験技術において、すべての競合する平衡を説明するプロセスが記述されている。本稿の焦点はCu(II)にあるが、記載された一連の実験はCu(II)-ペプチド相互作用を超えて適用することができ、生理学的に関連する条件下で他の金属ペプチド系を正確に定量するためのフレームワークを提供することができる。
Introduction
生物学は、生命が周囲の環境に適応し、生き残るために必要な金属イオンの多様な化学を利用するように進化してきました。タンパク質の推定25%〜50%が構造および機能1に金属イオンを使用する。金属イオンの特定の役割および酸化還元状態は、それを調整する生物学的リガンドの組成および幾何学的形状に直接関係する。さらに、Cu(II)などの酸化還元活性金属イオンは、フェントン様化学を介して酸化剤と相互作用して活性酸素種(ROS)2,3,4を形成しないように、厳密に調整する必要があります。その生化学を駆動する結合様式と親和性を理解することは、金属イオンの生物学的役割を解明するのに役立つはずです。
金属とペプチドの結合相互作用を研究するために多くの技術が使用されています。これらは主に分光学的手法ですが、アミロイドベータ(Aβ)5の断片とのCu(II)相互作用から見られるように、分子動力学を用いたコンピュータシミュレーションも含まれます。多くの大学がアクセスできる広く使用されている分光技術は、核磁気共鳴(NMR)です。Cu(II)の常磁性の性質を利用して、Gaggelliらは、近くの原子核6の緩和を通じて、金属イオンが小柄な上でどこで結合するかを示すことができた。電子常磁性共鳴(EPR)は、常磁性金属イオン結合7の位置および様式をプローブするために利用することもできる。円二色性(CD)などの他の分光技術は、トリペプチド系8などの系におけるCu(II)に関する配位を記述することができ、質量分析は化学量論および金属イオンが断片化パターン9,10を介してどの残基に配位されるかを示すことができる。
NMRなどのこれらの技術のいくつかは、標識フリーですが、大量のペプチドを必要とし、研究の課題を提起します。蛍光分光法と呼ばれる別の一般的な技術は、チロシンまたはトリプトファンの位置をCu(II)11,12からの消光に関連付けるために利用されている。同様に、この技術は、Cu(II)結合13の結果としての構造変化を示すことができる。しかし、これらの金属ペプチド結合研究の課題は、すべての系が持っているわけではないチロシンなどの発色性アミノ酸をプローブすること、金属イオンが古典的なモデルの下で結合すること、およびこの技術が生理学的条件下では助長されない可能性があることである。実際、そのような発色性アミノ酸を含まないか、または古典モデルの下で結合しないいくつかのペプチドが出現しており、これらの技術の使用を妨げている14、15。この記事では、生理学的に関連する条件下でこれらのシナリオで結合特性を評価するためのアプローチについて詳しく説明します。
生物学的リガンドは、ヒスチジン上のイミダゾール環などの金属イオン結合に影響を与え得る異なるプロトン化状態を採用し得る。pHが一貫して維持されていない場合、結果は複雑または矛盾する可能性があります。このため、バッファーは金属-タンパク質/ペプチド相互作用の研究において不可欠な成分です。しかしながら、多くの緩衝液は、金属イオン16、17と良好に相互作用することが示されている。目的の生体分子と競合することに加えて、緩衝液は、ペプチドまたはタンパク質の配位原子と区別することが困難な類似の配位原子を有し得る。本研究では、Cu(II)-ペプチド相互作用を研究するための2つの補完的手法として、緩衝液の選択に関する特別な考慮事項として、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定(ITC)に焦点を当てています。
電子吸収分光法は、金属結合相互作用を研究するための迅速で広くアクセス可能な技術です。紫外線(UV)または可視波長の光を照射すると、金属中心d-dバンドの吸収につながる可能性があり、配位子の分類、金属形状、および見かけ上の結合親和性に関する貴重な情報を提供します18,19。これらの複合体について、金属イオンをタンパク質またはペプチド溶液に直接滴定することで、結合化学量論および明らかな結合親和性を定量化することができる。d5またはd10電子配置などのいくつかの場合において、錯体は光を吸収しない(すなわち、分光学的に静かである)。これらの分光学的に静かな遷移金属錯体では、金属イオンに配位すると検出可能な電荷移動バンドを生成する競合する配位子を使用することによって、これらの制限を回避することができる。いずれの場合も、このアプローチは化学量論と明らかな結合親和性の定量化のみに限定され、近似なしでは結合エンタルピーに関する洞察は提供されません。
電子吸収分光法から得られた情報を補完するITCは、結合エンタルピー20の直接的かつ厳密な定量化のための魅力的な技術である。ITCは、結合事象中に放出または消費される熱を直接測定し、滴定は一定の圧力で行われるため、測定される熱はすべての平衡のエンタルピー(ΔHITC)です。さらに、結合事象(n)および見かけ上の結合親和性(KITC)の化学量論が定量化される。これらのパラメータから、自由エネルギー(ΔG ITC)およびエントロピー(ΔSITC)が決定され、結合事象の熱力学的スナップショットを提供する。ITCは光吸収に依存しないため、分光学的にサイレントな種、例えばd5またはd10金属イオン錯体にとって理想的な技術である。しかし、熱量測定は熱を測定するため、比類のないバッファーシステムや考慮されていない平衡は、金属イオン結合熱力学を正確に決定するための分析に悪影響を及ぼす可能性があり、これらの要因に対処するために細心の注意を払わなければなりません20。適切な厳密さで実施すれば、ITCは金属-タンパク質/ペプチド複合体の熱力学を決定するための堅牢な技術です。
ここでは、発色学的に静かな銅結合ペプチドであるC-ペプチドを使用して、2つの技術の相補的な使用を実証します。C-ペプチドは、インスリン成熟中に形成される31残基の切断産物(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)である。発色性残基を欠いているが、Cu(II)と生理学的に関連する親和性で結合することが示されている14,15。Cu(II)結合部位は、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩の側鎖、ならびにペプチド14,15のN末端からなる。これらの配位原子は、一般的に使用される多くの緩衝系の原子とよく似ている。ここでは、C-ペプチドへのCu(II)結合熱力学の定量における電子吸収分光法およびITCにおけるd-dおよび電荷移動バンドのタンデム使用が示されている。C-ペプチドへのCu(II)結合を研究することからのアプローチは、他の金属イオンおよびタンパク質/ペプチド系に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、ペプチドへのCu(II)結合の親和性と熱力学を定量化するための堅牢な方法を提供します。Cu(II)との錯体は、そのd9 電子配置のために金属部位のd-d吸収帯を監視するのに理想的である。吸光係数は小さいため、信頼性の高いシグナルを得るためには、より高い濃度の複合体が必要ですが、Cu(II)をペプチドに滴定すると、結合化学量論と近似結合親和性に関する洞察が迅速に得?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCはホワイトヘッド・サマー・リサーチ・フェローシップに感謝します。MJSは、サンフランシスコ大学のスタートアップファンドとファカルティ・ディベロップメント・ファンドに感謝します。MCHは、国立衛生研究所(NIH MIRA 5R35GM133684-02)および国立科学財団(NSF CAREER 2048265)からの資金提供を認めています。
Materials
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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