قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور
Summary
تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة لفحص وقياس الديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات والبروتينات.
Abstract
النحاس (II) هو معدن أساسي في النظم البيولوجية ، ويمنح خصائص كيميائية فريدة للجزيئات الحيوية التي يتفاعل معها. وقد أفيد أنه يرتبط مباشرة بمجموعة متنوعة من الببتيدات ويلعب أدوارا ضرورية ومرضية تتراوح من بنية الوساطة إلى خصائص نقل الإلكترون إلى نقل الوظيفة الحفازة. إن تحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية لمجمعات Cu(II)-peptide هذه في المختبر يوفر نظرة ثاقبة على القوة الدافعة الديناميكية الحرارية للربط ، والمسابقات المحتملة بين أيونات المعادن المختلفة للببتيد أو بين الببتيدات المختلفة ل Cu(II) ، وانتشار مركب Cu(II)-الببتيد في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة يمكن أن يكون تحديا بسبب عدد لا يحصى من العوامل، بما في ذلك حساب جميع التوازنات المتنافسة ضمن تجربة المعايرة، خاصة في الحالات التي يكون فيها هناك نقص في المقابض الطيفية المنفصلة التي تمثل الببتيد، وأيون المعدن d-block، وتفاعلاتهما.
هنا ، يتم توفير مجموعة قوية من التجارب لتحديد كمي دقيق للديناميكا الحرارية Cu(II)-peptide. تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص في وجود وغياب الروابط الكروموفورية لتوفير المقبض الطيفي اللازم على Cu(II) واستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة الخالي من الملصقات. في كلتا التقنيتين التجريبيتين ، يتم وصف العملية لحساب جميع التوازنات المتنافسة. في حين أن تركيز هذه المقالة ينصب على Cu(II) ، يمكن أن تنطبق مجموعة التجارب الموصوفة على ما وراء تفاعلات Cu(II) – الببتيد ، وتوفر إطارا للقياس الكمي الدقيق لأنظمة الببتيد المعدني الأخرى في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Introduction
تطورت البيولوجيا للاستفادة من الكيمياء المتنوعة لأيونات المعادن اللازمة للحياة للتكيف والبقاء على قيد الحياة في البيئة المحيطة بها. ما يقدر بنحو 25٪ -50٪ من البروتينات تستخدم أيونات المعادن للهيكل والوظيفة1. يرتبط الدور الخاص وحالة الأكسدة والاختزال لأيون المعدن ارتباطا مباشرا بتكوين وهندسة الروابط البيولوجية التي تنسقه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيم أيونات المعادن النشطة بالأكسدة والاختزال مثل Cu (II) بإحكام خشية أن تتفاعل مع العوامل المؤكسدة عبر كيمياء تشبه فينتون لتشكيل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 2،3،4. إن فهم أوضاع الربط والتقارب التي تقود الكيمياء الحيوية يجب أن يساعد في توضيح الدور البيولوجي لأيون المعدن.
تستخدم العديد من التقنيات لدراسة التفاعلات الملزمة للمعادن والببتيدات. هذه هي في الغالب تقنيات طيفية ولكنها تشمل أيضا محاكاة الكمبيوتر باستخدام الديناميكا الجزيئية ، كما يتضح من خلال تفاعلات Cu (II) مع جزء من بيتا أميلويد (Aβ)5. تقنية طيفية مستخدمة على نطاق واسع والتي يمكن الوصول إليها من قبل العديد من الجامعات هي الرنين المغناطيسي النووي (NMR). باستخدام الطبيعة البارامغناطيسية ل Cu(II) ، تمكن Gaggelli et al. من إظهار المكان الذي يرتبط فيه أيون المعدن على البتيد من خلال استرخاء النوى القريبة6. يمكن أيضا استخدام الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني (EPR) لاستكشاف موقع ووضع ربط أيون المعدن شبه المغناطيسي7. يمكن للتقنيات الطيفية الأخرى مثل الثنائيات الدائرية (CD) أن تصف التنسيق حول Cu (II) في أنظمة مثل أنظمة الببتيد الثلاثي8 ، ويمكن أن يظهر قياس الطيف الكتلي قياس stoichiometry وأي بقايا يتم تنسيق أيون المعدن من خلال أنماط التجزئة 9,10.
بعض هذه التقنيات ، مثل الرنين المغناطيسي النووي ، خالية من الملصقات ولكنها تتطلب تركيزات كبيرة من الببتيد ، مما يشكل تحديات للدراسة. تم استخدام تقنية شائعة أخرى تسمى التحليل الطيفي الفلوري لربط موضع التيروزين أو التربتوفان مع التبريد من Cu(II)11,12. وبالمثل ، يمكن لهذه التقنية إظهار التغيرات الهيكلية نتيجة لربط Cu (II)13. ومع ذلك ، فإن التحديات التي تواجه دراسات ربط الببتيد المعدني هذه هي أنها تسبر الأحماض الأمينية الكروموفورية مثل التيروزين التي لا تمتلكها جميع الأنظمة ، وأن أيون المعدن يرتبط بموجب نموذج كلاسيكي ، وأن هذه التقنية قد لا تكون مواتية في ظل الظروف الفسيولوجية. في الواقع ، تظهر العديد من الببتيدات التي لا تحتوي على مثل هذه الأحماض الأمينية الكروموفورية أو ترتبط بموجب النماذج الكلاسيكية ، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات14,15. توضح هذه المقالة بالتفصيل طرق تقييم خصائص الربط في هذه السيناريوهات في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
قد تعتمد الروابط البيولوجية حالات بروتونات مختلفة يمكن أن تؤثر على ربط أيون المعدن مثل حلقة الإيميدازول على الهستيدين. إذا لم يتم الحفاظ على درجة الحموضة باستمرار ، فقد تكون النتائج معقدة أو متضاربة. لهذا السبب ، تعد المخازن المؤقتة مكونا أساسيا في دراسة تفاعلات البروتين المعدني / الببتيد. ومع ذلك ، فقد ثبت أن العديد من المخازن المؤقتة تتفاعل بشكل إيجابي مع أيونات المعادن16,17. بالإضافة إلى التنافس مع الجزيء البيولوجي محل الاهتمام ، قد يكون للمخزن المؤقت ذرات منسقة مماثلة قد يكون من الصعب تمييزها عن الذرات المنسقة للببتيد أو البروتين. في هذه الدراسة ، ينصب التركيز على التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) كتقنيتين تكميليتين لدراسة تفاعلات Cu (II) – الببتيد ، مع اعتبارات خاصة تتعلق باختيار المخزن المؤقت.
التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص هو تقنية سريعة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المرتبطة بالمعادن. يمكن أن يؤدي التشعيع بالضوء في الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الأطوال الموجية المرئية إلى امتصاص نطاقات d-d المتمركزة حول المعادن ، والتي توفر معلومات قيمة عن تصنيف الليغاند ، والهندسة المعدنية ، وتقاربات الارتباط الواضحة18,19. بالنسبة لهذه المجمعات ، يمكن للمعايرة المباشرة لأيونات المعادن إلى محاليل البروتين أو الببتيد أن تحدد كميا مقاييس stoichiometry الملزمة والتقاربات الملزمة الواضحة. في بعض الحالات ، مثل تكوينات الإلكترون d5 أو d10 ، لا يمتص المجمع الضوء (أي أنه صامت طيفيا). في هذه المجمعات الفلزية الانتقالية الصامتة طيفيا ، يمكن التحايل على هذه القيود باستخدام رباط منافس ، عند التنسيق مع أيون المعدن ، ينتج نطاقات نقل شحنة يمكن اكتشافها. وفي كلتا الحالتين، يقتصر هذا النهج على القياس الكمي فقط لقياس الستويشيومتري والتقارب الواضح بين الروابط، ولا يتم توفير أي نظرة ثاقبة على المحتوى الحراري الملزم دون تقريب.
واستكمالا للمعلومات التي تم الحصول عليها من التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص، يعد مركز التجارة الدولية تقنية جذابة للقياس الكمي المباشر والصارم للمحتوى الحراري20 الملزم. يقيس مركز التجارة الدولية مباشرة الحرارة المنبعثة أو المستهلكة أثناء حدث ملزم ، وبما أن المعايرة بالتحليل الحجمي تتم عند ضغط ثابت ، فإن الحرارة المقاسة هي المحتوى الحراري لجميع التوازنات (ΔHITC). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد كمية قياس stoichiometry لحدث الربط (n) وتقارب الارتباط الظاهر (KITC). من هذه المعلمات ، يتم تحديد الطاقة الحرة (ΔG ITC) والإنتروبيا (ΔSITC) ، مما يوفر لقطة ديناميكية حرارية لحدث الربط. وبما أنه لا يعتمد على امتصاص الضوء، فإن مركز التجارة الدولية هو تقنية مثالية للأنواع الصامتة طيفيا، على سبيل المثال، d5 أو d10 مجمعات أيون معدنية. ومع ذلك ، نظرا لأن قياس السعرات الحرارية يقيس الحرارة ، فإن أي أنظمة عازلة لا مثيل لها وتوازن غير محسوب قد يؤثر سلبا على التحليل لتحديد الديناميكا الحرارية المرتبطة بأيون المعدن بدقة ، ويجب توخي الحذر الشديد لمعالجة هذه العوامل20. إذا تم تنفيذ ITC بدقة مناسبة ، فهي تقنية قوية لتحديد الديناميكا الحرارية لمجمعات البروتين المعدني / الببتيد.
هنا ، يتم استخدام ببتيد ملزم بالنحاس صامت كروموفوريا ، C-peptide ، لإثبات الاستخدام التكميلي للتقنيتين. الببتيد C هو منتج انقسام بقايا 31 (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) يتكون أثناء نضج الأنسولين. يفتقر إلى بقايا الكروموفوريك ولكن ثبت أنه يربط Cu (II) مع التقارب ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية14,15. يتكون موقع ربط Cu(II) من سلاسل جانبية من الغلوتامات والأسبارتات بالإضافة إلى المحطة N للببتيد14,15. تشبه هذه الذرات المنسقة إلى حد كبير تلك الموجودة في العديد من الأنظمة العازلة شائعة الاستخدام. هنا ، يظهر الاستخدام الترادفي لنطاقات نقل الشحنة d-d والشحنة في التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني و ITC في تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة Cu (II) بالببتيد C. يمكن تطبيق النهج من دراسة ارتباط Cu (II) بالببتيد C على أيونات المعادن الأخرى وأنظمة البروتين / الببتيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المقالة طريقة قوية لقياس التقارب والديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات. تعتبر المجمعات المزودة ب Cu(II) مناسبة بشكل مثالي لمراقبة نطاق امتصاص d-d في موقع المعدن بسبب تكوين الإلكترون d9 . على الرغم من أن معامل الانقراض صغير ، مما يتطلب تركيزات أكبر من المجمع لإنتاج إشارة مو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تشكر اللجنة العليا زمالة وايتهيد الصيفية للبحوث. تشكر MJS صناديق الشركات الناشئة وصندوق تطوير أعضاء هيئة التدريس في جامعة سان فرانسيسكو. تعترف MCH بالتمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH MIRA 5R35GM133684-02) والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF CAREER 2048265).
Materials
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O’Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D’Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions – a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. . Inorganic Chemistry. , (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT – A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. . Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
