Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas ^1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosforilación del receptor, tanto en abundancia como en los patrones específicos de fosfotirosina que pueden proporcionar un medio para manipular las salidas de señalización al dictar la composición del signalosoma 3,4,5,6,7. Sin embargo, existen limitaciones en los métodos actuales para interrogar la fosforilación de proteínas. El análisis de Western blot es excelente para describir las tendencias de la fosforilación de proteínas, pero es^{semicuantitativo 8} y no proporciona información sobre la heterogeneidad del sistema porque se promedian entre miles y millones de receptores. Si bien los western blots permiten sondear una muestra utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra tirosinas específicas, no pueden proporcionar información sobre los patrones de fosforilación multisitio dentro de la misma proteína. La fosfoproteómica cuantitativa informa sobre la abundancia de fosfotirosina, pero existen limitaciones para detectar la fosforilación multisitio, ya que los residuos de interés deben ubicarse dentro del mismo péptido (típicamente 7-35 aminoácidos) que se genera por la digestión enzimática ^9,10,11.

Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de extracción de una sola molécula (SiMPull) se ha adaptado para cuantificar los estados de fosforilación de los receptores intactos a nivel de molécula única. SiMPull fue demostrado por primera vez como una poderosa herramienta para interrogar complejos macromoleculares por Jain et ^al.12,13. En SiMPull, los complejos macromoleculares fueron inmunoprecipitados (IP) en cubiertas de vidrio funcionalizadas por anticuerpos y luego analizados a través de microscopía de molécula única para el número de subunidades de proteínas y co-IP con componentes complejos¹². Una modificación de Kim et ^al.14, denominada SiMBlot, fue la primera en utilizar una variación de SiMPull para analizar la fosforilación de proteínas desnaturalizadas. El protocolo SiMBlot se basa en la captura de proteínas biotiniladas de la superficie celular utilizando cápsulas recubiertas de NeutrAvidin, que luego se sondean para la fosforilación con el etiquetado de anticuerpos fosfoespecíficos¹⁴. A pesar de estos avances, se necesitaron mejoras para hacer que la cuantificación de la modificación posttraduccional fuera más robusta y aplicable a una gama más amplia de proteínas.

El presente protocolo describe un enfoque optimizado de SiMPull que se utilizó para cuantificar los patrones de fosforilación del receptor intacto del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en respuesta a una variedad de condiciones de ligando y mutaciones oncogénicas¹⁵. Si bien este trabajo se centra en EGFR, este enfoque se puede aplicar a cualquier receptor de membrana y proteínas citosólicas de interés (POI), para las cuales se dispone de anticuerpos de calidad. El protocolo incluye pasos para reducir la autofluorescencia de la muestra, un diseño de matriz de muestras que requiere un volumen mínimo de muestras con la preparación simultánea de hasta 20 muestras, y la optimización del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación. Se han desarrollado algoritmos de análisis de datos para la detección de moléculas individuales y la cuantificación de proteínas fosforiladas.