Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка
Summary
Настоящий протокол описывает пробоподготовку и анализ данных для количественной оценки фосфорилирования белка с использованием улучшенного анализа вытягивания одной молекулы (SiMPull).
Abstract
Фосфорилирование является необходимой посттрансляционной модификацией, которая регулирует функцию белка и направляет результаты передачи сигналов клетками. Современные методы измерения фосфорилирования белка не могут сохранить гетерогенность фосфорилирования в отдельных белках. Анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был разработан для исследования состава макромолекулярных комплексов путем иммунопреципитации белков на стеклянном покровном листе с последующей одномолекулярной визуализацией. Современный метод представляет собой адаптацию SiMPull, которая обеспечивает надежную количественную оценку состояния фосфорилирования полноразмерных мембранных рецепторов на уровне одной молекулы. Визуализация тысяч отдельных рецепторов таким образом позволяет количественно оценить паттерны фосфорилирования белка. Настоящий протокол детализирует оптимизированную процедуру SiMPull, от подготовки образца до визуализации. Оптимизация препаратов стекла и протоколов фиксации антител еще больше повышает качество данных. Текущий протокол предоставляет код для анализа одномолекулярных данных, который вычисляет фракцию рецепторов, фосфорилированных в образце. Хотя эта работа фокусируется на фосфорилировании рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), протокол может быть обобщен на другие мембранные рецепторы и цитозольные сигнальные молекулы.
Introduction
Мембранно-ассоциированная сигнализация настраивается комбинацией активации мембранных рецепторов, индуцированной лигандами, и рекрутирования последующих вспомогательных белков, которые распространяют сигнал. Фосфорилирование ключевых тирозинов в рецепторных цитоплазматических хвостах имеет решающее значение для инициирования образования сигнальных комплексов, или сигналосом 1,2. Поэтому важным вопросом в биологии является то, как создаются и поддерживаются паттерны фосфорилирования для привлечения сигнальных партнеров и диктовки клеточных результатов. Это включает в себя понимание гетерогенности фосфорилирования рецепторов, как в изобилии, так и в специфических паттернах фосфотирозина, которые могут обеспечить средство манипулирования сигнальными выходами путем диктовки составасигналосомы 3,4,5,6,7. Тем не менее, существуют ограничения в современных методах опроса фосфорилирования белка. Западный блот-анализ отлично подходит для описания тенденций фосфорилирования белка, но является полуколичественным8 и не дает информации о неоднородности системы, потому что тысячи и миллионы рецепторов усредняются вместе. В то время как западные пятна позволяют исследовать образец с использованием фосфоспецифических антител к специфическим тирозинам, они не могут предоставить информацию о многосайтовых моделях фосфорилирования в пределах одного белка. Количественная фосфопротеомика сообщает об изобилии фосфотирозина, но существуют ограничения на обнаружение многосайтового фосфорилирования, поскольку интересующие остатки должны быть расположены в пределах того же пептида (обычно 7-35 аминокислот), который генерируется ферментативным сбраживанием 9,10,11.
Чтобы преодолеть ограничения, упомянутые выше, анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был адаптирован для количественной оценки состояний фосфорилирования интактных рецепторов на уровне одной молекулы. SiMPull был впервые продемонстрирован в качестве мощного инструмента для опроса макромолекулярных комплексов Jain et al.12,13. В SiMPull макромолекулярные комплексы были иммунопреципитированы (IP) на стеклянных покровах, функционализированных антителами, а затем проанализированы с помощью одномолекулярной микроскопии для определения числа субъединиц белка и co-IP со сложными компонентами12. Модификация Kim et al.14, получившая название SiMBlot, была первой, которая использовала вариацию SiMPull для анализа фосфорилирования денатурированных белков. Протокол SiMBlot основан на захвате биотинилированных белков клеточной поверхности с использованием покрытых NeutrAvidin покровных пластинок, которые затем исследуются на предмет фосфорилирования с маркировкой фосфоспецифических антител14. Несмотря на эти достижения, необходимы улучшения, чтобы сделать количественную оценку посттрансляционной модификации более надежной и применимой к более широкому спектру белков.
Настоящий протокол описывает оптимизированный подход SiMPull, который использовался для количественной оценки паттернов фосфорилирования интактного рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в ответ на ряд лигандных состояний и онкогенных мутаций15. Хотя эта работа сосредоточена на EGFR, этот подход может быть применен к любому мембранному рецептору и представляющим интерес цитозольным белкам (POI), для которых доступны качественные антитела. Протокол включает в себя шаги по снижению автофлуоресценции образца, конструкцию массива образцов, которая требует минимального объема образца с одновременной подготовкой до 20 образцов, а также оптимизацию условий маркировки и фиксации антител. Разработаны алгоритмы анализа данных для обнаружения одной молекулы и количественной оценки фосфорилированных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для проведения количественных измерений фосфорилирования рецепторов на уровне одного белка. Было разработано несколько простых, но важных модификаций протокола SiMPull, которые повысили надежность измерения для обнаружения фосфо-тирозина, в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения R35GM126934, R01AI153617 и R01CA248166 для DSL. EMB поддерживался в рамках программы ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) и JAR в рамках программы UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Мы с благодарностью отмечаем использование общего ресурса флуоресцентной микроскопии Комплексного онкологического центра Университета Нью-Мексико, поддерживаемого NIH P30CA118100. Мы хотим отметить докторов Анкура Джайна и Тхэкиджипа Ха, чья оригинальная разработка SiMPull вдохновила эту работу.
ES-C нынешний адрес: Группа иммунодинамики, Лаборатория интегративной иммунологии рака, Центр исследований рака, Национальный институт рака, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
