タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

膜関連シグナル伝達は、リガンド誘導膜受容体活性化およびシグナルを伝播する下流補助タンパク質の動員の組み合わせによって同調される。受容体細胞質尾部における重要なチロシンのリン酸化は、シグナル伝達複合体、またはシグナル伝達体^1,2の形成を開始するのに重要である。したがって、生物学における重要な問題は、シグナル伝達パートナーを募集し、細胞転帰を決定するために、リン酸化パターンがどのように作成され、維持されるかである。これには、シグナル伝達3,4,5,6,7の組成を指示することによってシグナル伝達出力を操作する手段を提供できる存在量および特定のホスホチロシンパターンの両方における受容体リン酸化の不均一性を理解することが含まれる。しかしながら、タンパク質リン酸化を疑問視する現在の方法には限界がある。ウェスタンブロット分析は、タンパク質リン酸化の傾向を記述するのには優れていますが、半定量的8であり、数千から数百万の受容体が一緒に平均化されるため^、システムの不均一性に関する情報を提供しません。ウェスタンブロットは、特定のチロシンに対するホスホ特異的抗体を使用してサンプルをプロービングすることを可能にするが、同じタンパク質内のマルチサイトリン酸化パターンに関する情報を提供することはできない。定量的ホスホプロテオミクスはホスホチロシンの存在量について報告するが、目的の残基が酵素消化によって生成されるのと同じペプチド(典型的には7〜35アミノ酸)内に位置する必要があるため、マルチサイトリン酸化を検出することには限界がある⁹、^10、11。

上記の制限を克服するために、単一分子プルダウン(SiMPull)アッセイは、一分子レベルでインタクトな受容体のリン酸化状態を定量化するように適合されている。SiMPullは、Jainらによって高分子複合体を尋問するための強力なツールとして最初に実証された^12,13。SiMPullでは、高分子複合体を抗体官能化ガラスカバースリップ上で免疫沈降(IP)し、次いでタンパク質サブユニット数および複合体成分¹²とのco-IPについて一分子顕微鏡を通して分析した。SiMBlotと呼ばれるKimら¹⁴による改変は、変性タンパク質のリン酸化を分析するためにSiMPullのバリエーションを使用した最初の改変であった。SiMBlotプロトコルは、NeutrAvidinコーティングされたカバースリップを使用してビオチン化細胞表面タンパク質を捕捉することに依存しており、その後、リン酸化についてリン酸化についてリン酸化がプローブされる¹⁴。これらの進歩にもかかわらず、翻訳後修飾の定量化をより堅牢にし、より広い範囲のタンパク質に適用できるようにするには、改善が必要でした。

本プロトコールは、リガンド条件および発癌性変異の範囲に応答してインタクトな上皮成長因子受容体(EGFR)のリン酸化パターンを定量するために使用された最適化されたSiMPullアプローチを記載する¹⁵。この研究はEGFRに焦点を当てていますが、このアプローチは、高品質の抗体が利用可能な目的の膜受容体および細胞質ゾルタンパク質(POI)に適用することができます。このプロトコルには、サンプルの自己蛍光を低減する手順、最大 20 個のサンプルを同時に調製して最小限のサンプル量を必要とするサンプルアレイ設計、抗体標識および固定条件の最適化が含まれています。リン酸化タンパク質の単一分子検出および定量のために、データ解析アルゴリズムが開発されています。