בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים ^1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות לחקור זרחון חלבונים. ניתוח כתמים מערביים מצוין לתיאור מגמות של זרחון חלבונים, אך הוא כמותי למחצה⁸ ואינו מספק מידע על ההטרוגניות של המערכת מכיוון שאלפי עד מיליוני קולטנים ממוצעים יחד. בעוד שהכתמים המערביים מאפשרים לחקור דגימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו לטירוזינים ספציפיים, הם אינם יכולים לספק מידע על דפוסי זרחון מרובי אתרים בתוך אותו חלבון. פוספופרוטומיקה כמותית מדווחת על שפע פוספוטירוזין, אך ישנן מגבלות לאיתור זרחון מרובה אתרים, שכן שאריות העניין צריכות להיות ממוקמות בתוך אותו פפטיד (בדרך כלל 7-35 חומצות אמינו) שנוצר על ידי עיכול אנזימטי ^9,10,11.

כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, בדיקת המשיכה של מולקולה אחת כלפי מטה (SiMPull) הותאמה לכימות מצבי הזרחון של קולטנים שלמים ברמת המולקולה הבודדת. SiMPull הוכח לראשונה ככלי רב עוצמה לחקירת קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי Jain et ^al.12,13. ב-SiMPull, קומפלקסים מקרומולקולריים עברו מיצוי חיסוני (IP) על כיסויי זכוכית פונקציונליים של נוגדנים ולאחר מכן נותחו באמצעות מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת עבור מספר תת-יחידה של חלבונים ו-CO-IP עם רכיבים מורכבים¹². שינוי של Kim et ^al.14, המכונה SiMBlot, היה הראשון שהשתמש בווריאציה של SiMPull כדי לנתח פוספורילציה של חלבונים שעברו דנטורציה. פרוטוקול SiMBlot מסתמך על לכידת חלבוני פני השטח של התאים שעברו ביוטינילציה באמצעות כיסויים מצופים NeutrAvidin, אשר נבדקים לאחר מכן לזרחון עם תוויות נוגדנים ספציפיות לפוספו¹⁴. למרות ההתקדמות הזו, היה צורך בשיפורים כדי להפוך את הכימות של שינויים פוסט-טרנסלציוניים לחזק יותר וישים יותר למגוון רחב יותר של חלבונים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישת SiMPull אופטימלית ששימשה לכימות דפוסי זרחון של קולטן גורם גדילה אפידרמלי שלם (EGFR) בתגובה למגוון מצבי ליגנד ומוטציות אונקוגניות¹⁵. בעוד שעבודה זו מתמקדת ב- EGFR, ניתן ליישם גישה זו על כל קולטן ממברנה וחלבונים ציטוזוליים בעלי עניין (POI), שעבורם קיימים נוגדנים איכותיים. הפרוטוקול כולל שלבים להפחתת הפלואורסצנציה אוטומטית של דגימה, תכנון מערך דגימות הדורש נפח דגימה מינימלי עם הכנה סימולטנית של עד 20 דגימות, ואופטימיזציה של תווי תיוג נוגדנים ותנאי קיבוע. אלגוריתמים לניתוח נתונים פותחו לזיהוי וכימות של מולקולות בודדות של חלבונים זרחניים.