Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen ^1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenität der Rezeptorphosphorylierung, sowohl im Überfluss als auch in den spezifischen Phosphotyrosinmustern, die ein Mittel zur Manipulation der Signalausgänge bieten können, indem sie die Zusammensetzung des Signalosoms 3,4,5,6,7 diktieren. Es gibt jedoch Einschränkungen in den derzeitigen Methoden zur Abfrage der Proteinphosphorylierung. Die Western-Blot-Analyse eignet sich hervorragend zur Beschreibung von Trends der Proteinphosphorylierung, ist jedoch semi-quantitativ⁸ und liefert keine Informationen über die Heterogenität des Systems, da Tausende bis Millionen von Rezeptoren zusammen gemittelt werden. Während westliche Blots die Untersuchung einer Probe mit Phospho-spezifischen Antikörpern gegen bestimmte Tyrosine ermöglichen, können sie keine Informationen über Multisite-Phosphorylierungsmuster innerhalb desselben Proteins liefern. Quantitative Phosphoproteomiken berichten über die Phosphotyrosin-Häufigkeit, aber es gibt Einschränkungen beim Nachweis der Multisite-Phosphorylierung, da sich die interessierenden Reste innerhalb desselben Peptids (typischerweise ^7-35 Aminosäuren) befinden müssen, das durch enzymatische Verdauung erzeugt wird ^9,10,11.

Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde der Einzelmolekül-Pull-Down-Assay (SiMPull) angepasst, um die Phosphorylierungszustände intakter Rezeptoren auf Einzelmolekülebene zu quantifizieren. SiMPull wurde erstmals von Jain et ^al.12,13 als leistungsfähiges Werkzeug zur Befragung makromolekularer Komplexe demonstriert. In SiMPull wurden makromolekulare Komplexe immunpräzipitiert (IP) auf Antikörper-funktionalisierten Glasdeckgläsern und dann durch Einzelmolekülmikroskopie auf Proteinuntereinheitennummer und Co-IP mit komplexen Komponenten^{analysiert 12}. Eine Modifikation von Kim et ^al.14, genannt SiMBlot, war die erste, die eine Variation von SiMPull verwendete, um die Phosphorylierung von denaturierten Proteinen zu analysieren. Das SiMBlot-Protokoll beruht auf der Erfassung biotinylierter Zelloberflächenproteine unter Verwendung von NeutrAvidin-beschichteten Deckgläsern, die dann zur Phosphorylierung mit Phospho-spezifischer Antikörpermarkierung^{untersucht werden 14}. Trotz dieser Fortschritte waren Verbesserungen erforderlich, um die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikation robuster und auf ein breiteres Spektrum von Proteinen anwendbarer zu machen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen optimierten SiMPull-Ansatz, der verwendet wurde, um Phosphorylierungsmuster des intakten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) als Reaktion auf eine Reihe von Ligandenbedingungen und onkogenen Mutationen zu quantifizieren¹⁵. Während sich diese Arbeit auf EGFR konzentriert, kann dieser Ansatz auf jeden Membranrezeptor und zytosolische Proteine von Interesse (POI) angewendet werden, für die hochwertige Antikörper verfügbar sind. Das Protokoll umfasst Schritte zur Reduzierung der Probenautofluoreszenz, ein Probenarray-Design, das ein minimales Probenvolumen bei gleichzeitiger Vorbereitung von bis zu 20 Proben erfordert, und die Optimierung der Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen. Datenanalysealgorithmen wurden für den Einzelmolekülnachweis und die Quantifizierung phosphorylierter Proteine entwickelt.