اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين
Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتحليل البيانات لتحديد كمية فسفرة البروتين باستخدام فحص محسن للسحب أحادي الجزيء (SiMPull).
Abstract
الفسفرة هي تعديل ضروري بعد الترجمة ينظم وظيفة البروتين ويوجه نتائج إشارات الخلايا. لا يمكن للطرق الحالية لقياس فسفرة البروتين الحفاظ على عدم التجانس في الفسفرة عبر البروتينات الفردية. تم تطوير اختبار السحب أحادي الجزيء (SiMPull) للتحقيق في تكوين المجمعات الجزيئية الكبيرة عن طريق الترسيب المناعي للبروتينات على غطاء زجاجي متبوعا بتصوير جزيء واحد. التقنية الحالية هي تكيف مع SiMPull يوفر تقديرا كميا قويا لحالة الفسفرة لمستقبلات الغشاء كاملة الطول على مستوى الجزيء الواحد. يسمح تصوير الآلاف من المستقبلات الفردية بهذه الطريقة بتحديد أنماط فسفرة البروتين. يفصل البروتوكول الحالي إجراء SiMPull الأمثل ، من إعداد العينات إلى التصوير. إن تحسين إعداد الزجاج وبروتوكولات تثبيت الأجسام المضادة يزيد من تحسين جودة البيانات. يوفر البروتوكول الحالي رمزا لتحليل بيانات الجزيء الواحد الذي يحسب جزء المستقبلات المفسفرة داخل العينة. بينما يركز هذا العمل على فسفرة مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) ، يمكن تعميم البروتوكول على مستقبلات الغشاء الأخرى وجزيئات الإشارات الخلوية.
Introduction
يتم ضبط الإشارات المرتبطة بالغشاء عن طريق مزيج من تنشيط مستقبلات الغشاء التي يسببها الليغاند وتوظيف البروتينات الملحقة في المصب التي تنشر الإشارة. الفسفرة من التيروزين الرئيسية في ذيول السيتوبلازم المستقبلات أمر بالغ الأهمية لبدء تشكيل مجمعات الإشارات ، أو السيلوسومات 1,2. لذلك ، فإن السؤال المهم في علم الأحياء هو كيف يتم إنشاء أنماط الفسفرة والحفاظ عليها لتجنيد شركاء الإشارات وإملاء النتائج الخلوية. ويشمل ذلك فهم عدم تجانس فسفرة المستقبلات ، سواء في الوفرة أو في أنماط الفوسفوتيروزين المحددة التي يمكن أن توفر وسيلة للتلاعب بمخرجات الإشارات عن طريق إملاء تكوين الإشارة3،4،5،6،7. ومع ذلك ، هناك قيود في الطرق الحالية لاستجواب فسفرة البروتين. تحليل اللطخة الغربية ممتاز لوصف اتجاهات فسفرة البروتين ولكنه شبه كمي8 ولا يوفر معلومات عن عدم تجانس النظام لأن الآلاف إلى الملايين من المستقبلات يتم حسابها في المتوسط معا. في حين أن البقع الغربية تسمح بفحص عينة باستخدام أجسام مضادة خاصة بالفوسفو لتيروزينات محددة ، إلا أنها لا تستطيع توفير معلومات عن أنماط الفسفرة متعددة المواقع داخل نفس البروتين. تقرير الفوسفوبروتينات الكمي عن وفرة الفوسفوتيروزين ، ولكن هناك قيود على اكتشاف الفسفرة متعددة المواقع ، حيث يجب أن تكون المخلفات ذات الأهمية موجودة داخل نفس الببتيد (عادة 7-35 من الأحماض الأمينية) التي يتم إنشاؤها بواسطة الهضم الأنزيمي9،10،11.
للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، تم تكييف اختبار السحب أحادي الجزيء (SiMPull) لتحديد حالات الفسفرة للمستقبلات السليمة على مستوى الجزيء الواحد. تم إثبات SiMPull لأول مرة كأداة قوية لاستجواب المجمعات الجزيئية الكبيرة بواسطة Jain et al.12,13. في SiMPull ، تم ترسيب المجمعات الجزيئية الكبيرة (IP) على أغطية زجاجية وظيفية للأجسام المضادة ثم تم تحليلها من خلال الفحص المجهري أحادي الجزيء لعدد الوحدات الفرعية للبروتين و IP المشترك مع المكونات المعقدة12. كان التعديل الذي أجراه كيم وآخرون 14 ، والذي أطلق عليه اسم SiMBlot ، أول من استخدم اختلافا في SiMPull لتحليل فسفرة البروتينات المشوهة. يعتمد بروتوكول SiMBlot على التقاط بروتينات سطح الخلايا البيوتينيل باستخدام أغطية مغلفة ب NeutrAvidin، والتي يتم فحصها بعد ذلك للفسفرة باستخدام وضع العلامات على الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو14. وعلى الرغم من هذه التطورات، كانت هناك حاجة إلى تحسينات لجعل القياس الكمي للتعديل بعد الترجمة أكثر قوة وقابلية للتطبيق على مجموعة أوسع من البروتينات.
يصف هذا البروتوكول نهج SiMPull الأمثل الذي تم استخدامه لتحديد أنماط الفسفرة لمستقبلات عامل نمو البشرة السليمة (EGFR) استجابة لمجموعة من ظروف الرباط والطفرات الورمية15. بينما يركز هذا العمل على EGFR ، يمكن تطبيق هذا النهج على أي مستقبلات غشائية وبروتينات خلوية ذات أهمية (POI) ، والتي تتوفر لها أجسام مضادة عالية الجودة. يتضمن البروتوكول خطوات لتقليل التألق الذاتي للعينات ، وتصميم صفيف العينات الذي يتطلب الحد الأدنى من حجم العينة مع التحضير المتزامن لما يصل إلى 20 عينة ، وتحسين ظروف وضع العلامات على الأجسام المضادة وتثبيتها. تم تطوير خوارزميات تحليل البيانات للكشف عن جزيء واحد وتحديد كمية البروتينات المفسفرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تحسين البروتوكول الموصوف هنا لتمكين القياسات الكمية لفسفرة المستقبلات على مستوى البروتين الواحد. تم تطوير العديد من التعديلات المباشرة ولكنها مهمة على بروتوكول SiMPull التي حسنت موثوقية القياس للكشف عن الفوسفو التيروزين ، بما في ذلك الحد من التألق الذاتي مع علاج NaBH4 وما بعد تثبيت ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R35GM126934 و R01AI153617 و R01CA248166 إلى DSL. تم دعم هيئة إدارة الانتخابات من خلال برنامج ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) و JAR من قبل برنامج UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). نحن نقر بامتنان باستخدام المورد المشترك للفحص المجهري الفلوري لمركز السرطان الشامل بجامعة نيو مكسيكو ، بدعم من NIH P30CA118100. نود أن نعترف بالدكتورين أنكور جاين وتايكيجيب ها ، اللذين ألهم تطويرهما الأصلي ل SiMPull هذا العمل.
ES-C الكلمة الحالية: مجموعة الديناميكا المناعية ، مختبر المناعة التكاملية للسرطان ، مركز أبحاث السرطان ، المعهد الوطني للسرطان ، بيثيسدا
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
