Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi
Summary
Bu protokol, otoimmün hastalığın gelişimi sırasında murin bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit, uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi sağlar.
Abstract
Bağırsak mikrobiyotası bağışıklık sisteminin eğitiminde önemli bir role sahiptir. Bu ilişki, sadece genetik faktörler tarafından yönlendirilen otoimmün hastalıkları değil, aynı zamanda hastalığın başlangıcını tetikleyebilecek ve / veya hastalığın seyrini kötüleştirebilecek çevresel faktörleri anlamak için son derece önemlidir. Lupus eğilimli MRL / lpr dişi farelerde bağırsak mikrobiyotasının dinamikleri üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma, bağırsak mikrobiyotasındaki değişikliklerin hastalığın ilerlemesini nasıl değiştirebileceğini göstermiştir. Burada, otoimmünite çalışmaları için bağırsak mikrobiyotasından temsili örneklerin çıkarılması için bir protokol açıklanmaktadır. Mikrobiyota örnekleri anüsten toplanır ve DNA’nın bir fenol-kloroform yöntemi kullanılarak ekstrakte edildiği ve alkol çökeltmesi ile saflaştırıldığı işlenir. PCR yapıldıktan sonra, saflaştırılmış amplikler Argonne Ulusal Laboratuvarı’nda Yeni Nesil Dizileme platformu kullanılarak sıralanır. Son olarak, 16S ribozomal RNA gen dizileme verileri analiz edilir. Örnek olarak, CX3CR1 olan veya olmayan MRL / lpr farelerinin bağırsak mikrobiyota karşılaştırmalarından elde edilen veriler gösterilmiştir. Sonuçlar, filum Proteobakteriler gibi patojenik bakteriler içeren cinslerde ve sağlıklı kommensal mikrobiyotanın bir parçası olarak kabul edilen Bifidobacterium cinsinde önemli farklılıklar göstermiştir. Özetle, bu basit, uygun maliyetli DNA izolasyon yöntemi güvenilirdir ve otoimmün hastalıklarla ilişkili bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin araştırılmasına yardımcı olabilir.
Introduction
İnsanlar ve bakteriler uzun süredir bir arada var olmuşlardır. Konakçı immün yanıtlarını nicel ve nitel yollarla etkileyen karşılıklı yararlı etkilerle birlikte bağımlı bir ilişki kurmuşlardır1. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyota bileşimi ile multipl skleroz 2, romatoid artrit3, tip2 diyabet4, İnflamatuar bağırsak hastalığı5 ve sistemik lupus eritematozus (SLE)6’yı içeren otoimmün hastalıkların patogenezi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotasının bu otoimmün hastalıkların ana nedeni mi yoksa ikincil bir etkisi mi olduğu hala belirsizdir7. Potansiyel olarak, bağırsak mikrobiyotası, otoimmün bozuklukların efektör fazı sırasında hastalığı şiddetlendirebilir veya bu hastalıkların indüksiyonunu düzenlemede rol oynayabilir8.
Lupus eğilimli dişi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) farelerde intestinal dysbiosis bildirilmiştir ve Lactobacilli’nin belirgin bir şekilde tükenmesiyle bağırsak mikrobiyota değişiklikleri gözlenmiştir9. Beş Lactobacillus suşunun bir karışımı oral yoldan uygulandığında, bu farelerde lupus benzeri semptomlar büyük ölçüde azaldı ve bu da SLE patogenezini düzenlemede mikrobiyotanın önemli bir rol oynadığını düşündürdü.
Aşağıdaki DNA ekstraksiyon tekniği, lupus eğilimli farelerde murin SLE benzeri hastalığın seyri sırasında mikrobiyota dalgalanmalarını takip etmeyi ve bunları kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmeyi sağlar. Sağlıklı bağırsak mikrobiyotasını incelemek veya dysbiosis’i tanımlamak olsun, verilerin nasıl toplandığını ve doğru ve tekrarlanabilir olup olmadığını eleştirel olarak incelemek önemlidir10. Bu süreçte atılan her adım kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal DNA’yı çıkarmak için uygun bir metodoloji kullanılmalıdır, çünkü DNA ekstraksiyon işlemi sırasında önyargılara neden olan olası herhangi bir sorun, yanlış mikrobiyal temsile neden olabilir. Fenol-kloroform yöntemi burada tarif edilirken, belirli durumlarda iyi çalışan bakterilerden DNA çıkarmak için ticari olarak temin edilebilen kitler vardır11. Bununla birlikte, kullanılabilirlikleri maliyet ve gerekli numune miktarı ile sınırlıdır.
Burada sunulan protokol uygun maliyetlidir ve sadece az miktarda örnek gerektirir. Her türlü dışkı örneği ile iyi çalışır ve zaman içinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini ve gruplar arasındaki karşılaştırmaları incelemede yararlıdır. DNA, fenol, kloroform ve izoamil alkol kullanan bir alkol saflaştırma yöntemi ile izole edilir. Alkol bazlı ekstraksiyon, DNA’nın son adımda çökeldiği protein ve lipit örneğinin temizlenmesine ve çıkarılmasına yardımcı olur. Önerilen yöntem önemli ölçüde yüksek verimlilik ve kaliteye sahiptir ve bakteri popülasyonlarının tanımlanmasında doğru olduğu kanıtlanmıştır. İşlem sırasında kritik bir not, DNA kontaminasyonunun meydana gelebileceği ve bu nedenle uygun numune elleçlemesinin gerekli olduğudur12.
DNA daha sonra Illumina MiSeq gibi 16S rRNA geni için Yeni Nesil Dizileme platformları tarafından analiz edilir. Özellikle, V4 hiper değişken bölgesi, yüksek dereceli taksonlar13 için daha iyi bir niceleme sağlamak üzere analiz edilir. Sonraki biyoinformatik analizler dış kaynaklı olup, bunu standart istatistiksel yöntemler kullanılarak kurum içi analiz izlemektedir. Aşağı akış dizilimi için çok sayıda açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı mevcuttur ve yapılan analizlerin türü büyük ölçüde ilgilenilen spesifik biyolojik soruya bağlıdır14. Bu protokol özellikle dizilemeden önceki deneysel adımlara odaklanır ve dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli, karşılaştırılabilir ve verimli bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dengeli bağırsak mikrobiyotası insan vücudunu hastalıklardan koruyabilir. Bu denge dış veya iç tetikleyiciler tarafından bozulduğunda, sonuçlar yıkıcı olabilir. Bu yöntem, murin modellerinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini analiz etmenin bir yolunu sunar. Yöntem sadece gruplar arasındaki karşılaştırmalar için değil, aynı zamanda bağırsak mikrobiyotasını bozan zamana bağlı faktörleri daha iyi tanımlamak için bağırsak mikrobiyotasını zaman içinde izlemek için de uygundur.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Argonne Ulusal Laboratuvarı’nın ve işbirliği yapan biyoinformatikçilerimizin yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
