Анализ динамики фекальной микробиоты у мышей, склонных к волчанке, с использованием простого, экономически эффективного метода выделения ДНК

Люди и бактерии сосуществуют уже давно. Они установили созависимую связь с взаимовыгодными эффектами, которая влияет на иммунные реакции хозяина количественными и качественными способами¹. Недавние исследования предполагают связь между составом микробиоты кишечника и патогенезом аутоиммунных заболеваний, которые включают рассеянный склероз², ревматоидный артрит³, диабет 2 типа⁴, воспалительное заболевание кишечника⁵ и системную красную волчанку (СКВ)⁶. Однако является ли микробиота кишечника основной причиной или вторичным эффектом этих аутоиммунных заболеваний, до сих пор неясно⁷. Потенциально микробиота кишечника может усугубить заболевание во время эффекторной фазы аутоиммунных расстройств или играть роль в регулировании индукции этих заболеваний⁸.

Сообщалось о дисбактериозе кишечника у самок мышей MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr), а изменения микробиоты кишечника со значительным истощением лактобактерий наблюдались⁹. Когда смесь из пяти штаммов Lactobacillus вводилась перорально, симптомы, подобные волчанке, были в значительной степени ослаблены у этих мышей, что свидетельствует о существенной роли микробиоты в регулировании патогенеза СКВ.

Следующая методика экстракции ДНК позволяет отслеживать колебания микробиоты и анализировать их качественно и количественно при течении мышиной СКВ-подобной болезни у склонных к волчанке мышей. Независимо от того, следует ли исследовать здоровую микробиоту кишечника или определить дисбактериоз, важно критически изучить, как собираются данные и являются ли они точными и воспроизводимыми¹⁰. Каждый шаг имеет решающее значение в этом процессе. Для извлечения микробной ДНК необходимо использовать соответствующую методологию, поскольку любая возможная проблема, приводящая к смещениям в процессе экстракции ДНК, может привести к неточному микробному представлению. Хотя фенол-хлороформный метод описан здесь, существуют коммерчески доступные наборы для извлечения ДНК из бактерий, которые хорошо работают в конкретных случаях¹¹. Однако их удобство использования ограничено стоимостью и необходимым количеством образцов.

Протокол, представленный здесь, является экономически эффективным и требует лишь небольшого количества выборки. Он отлично работает с любым типом образца стула и полезен для изучения динамики микробиоты кишечника с течением времени, а также для сравнения между группами. ДНК выделяют методом очистки спирта, в котором используют фенол, хлороформ и изоамиловый спирт. Экстракция на спиртовой основе помогает очистить и удалить образец белков и липидов, где ДНК выпадает в осадок на заключительном этапе. Предложенный метод обладает значительно высокой эффективностью и качеством и доказал свою точность при выявлении бактериальных популяций. Одним из критических замечаний во время процедуры является то, что может произойти загрязнение ДНК, и, таким образом, требуется соответствующая обработка образцов¹².

Затем ДНК анализируется платформами секвенирования следующего поколения для гена 16S рРНК, такими как Illumina MiSeq. В частности, гипервариабельная область V4 анализируется для обеспечения лучшей количественной оценки для высокоранговых таксонов¹³. Последующий анализ биоинформатики передается на аутсорсинг, за которым следует внутренний анализ с использованием стандартных статистических методов. Существует множество программ биоинформатики с открытым исходным кодом, доступных для последующего секвенирования, и тип выполняемых анализов в значительной степени зависит от конкретного биологического вопроса, представляющего интерес¹⁴. Этот протокол фокусируется конкретно на экспериментальных этапах до секвенирования и обеспечивает более универсальный, экономически эффективный, сопоставимый и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий.