Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Humanos e bactérias coexistem há muito tempo. Eles estabeleceram uma relação codependente com efeitos benéficos mútuos que influencia as respostas imunes do hospedeiro de forma quantitativa e qualitativa¹. Estudos recentes sugerem uma associação entre a composição da microbiota intestinal e a patogênese de doenças autoimunes que incluem esclerose múltipla 2, artrite reumatoide³, diabetes tipo^{2 4}, doença inflamatória intestinal⁵ e lúpus eritematoso sistêmico (LES)⁶. No entanto, ainda não está claro se a microbiota intestinal é a principal causa ou um efeito secundário dessas doenças autoimunes⁷. Potencialmente, a microbiota intestinal poderia exacerbar a doença durante a fase efetora de doenças autoimunes ou desempenhar um papel na regulação da indução dessas doenças⁸.

Disbiose intestinal foi relatada em camundongos fêmeas com LMR/Mp-Faslpr (LMR/lpr) propensos a lúpus, e alterações na microbiota intestinal com uma depleção significativa de Lactobacilos foram observadas⁹. Quando uma mistura de cinco cepas de Lactobacillus foi administrada por via oral, sintomas semelhantes ao lúpus foram amplamente atenuados nesses camundongos, sugerindo um papel essencial da microbiota na regulação da patogênese do LES.

A seguinte técnica de extração de DNA permite acompanhar as flutuações da microbiota e analisá-las qualitativa e quantitativamente durante o curso da doença murina semelhante ao LES em camundongos propensos ao lúpus. Seja para examinar a microbiota intestinal saudável ou definir disbiose, é importante examinar criticamente como os dados são coletados e se são precisos e reprodutíveis¹⁰. Cada passo é fundamental nesse processo. Deve ser utilizada uma metodologia adequada para extrair ADN microbiano, uma vez que qualquer possível problema que introduza vieses durante o processo de extracção de ADN pode resultar numa representação microbiana imprecisa. Embora o método fenol-clorofórmio seja descrito aqui, existem kits comercialmente disponíveis para extrair DNA de bactérias que funcionam bem em casos particulares¹¹. No entanto, sua usabilidade é limitada pelo custo e pela quantidade de amostra necessária.

O protocolo aqui apresentado é custo-efetivo e requer apenas uma pequena quantidade de amostra. Ele funciona bem com qualquer tipo de amostra de fezes e é útil no estudo da dinâmica da microbiota intestinal ao longo do tempo, bem como comparações entre grupos. O DNA é isolado com um método de purificação de álcool, que usa fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A extração à base de álcool ajuda a limpar e remover a amostra de proteínas e lipídios, onde o DNA é precipitado na etapa final. O método proposto tem eficiência e qualidade significativamente altas e provou ser preciso na identificação de populações bacterianas. Uma observação crítica durante o procedimento é que a contaminação do DNA pode ocorrer e, portanto, o manuseio adequado da amostra é necessário¹².

O DNA é então analisado pelas plataformas Next Generation Sequencing para o gene 16S rRNA, como o Illumina MiSeq. Em particular, a região hipervariável V4 é analisada para fornecer uma melhor quantificação para táxons de alto nível¹³. A análise bioinformática subsequente é terceirizada, seguida de análise interna usando métodos estatísticos padrão. Existem inúmeros softwares de bioinformática de código aberto disponíveis para sequenciamento a jusante, e o tipo de análise realizada depende fortemente da questão biológica específica de interesse¹⁴. Este protocolo se concentra especificamente nas etapas experimentais anteriores ao sequenciamento e fornece um método mais versátil, econômico, comparável e eficiente para obter DNA de amostras fecais.