簡単で費用対効果の高いDNA単離法を用いたループス発生マウスの糞便微生物叢動態の解析(英語)

人間とバクテリアは長い間共存してきました。彼らは、宿主の免疫応答に定量的および定性的な方法で影響を与える相互有益な効果との共依存関係を確立しました¹。最近の研究では、腸内細菌叢の組成と、多発性硬化症2、関節リウマチ³、²型糖尿病⁴、炎症性腸疾患⁵、全身性エリテマトーデス(SLE)⁶などの自己免疫疾患の病因との関連が示唆されています。しかし、腸内細菌叢がこれらの自己免疫疾患の主な原因なのか二次的な影響なのかはまだ不明です⁷。潜在的に、腸内細菌叢は自己免疫疾患のエフェクター段階で病気を悪化させたり、これらの病気の誘発を調節する役割を果たす可能性があります⁸。

腸内細菌叢症は、狼瘡が発生しやすいMRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr)マウスで報告されており、乳酸菌の有意な枯渇を伴う腸内細菌叢の変化が観察されました⁹。5種類のラクトバチルス菌株を混合して経口投与したところ、狼瘡様症状は大きく軽減され、SLEの病態調節における微生物叢の重要な役割が示唆された。

以下のDNA抽出技術は、狼瘡を起こしやすいマウスのマウスSLE様疾患の過程で微生物叢の変動を追跡し、定性的および定量的に分析することを可能にする。健康な腸内細菌叢を調べるか、嚥下障害を定義するかにかかわらず、データがどのように収集され、それが正確で再現性があるかどうかを批判的に検討することが重要です¹⁰。このプロセスでは、すべてのステップが重要です。DNA抽出プロセス中にバイアスを導入する可能性のある問題は、微生物の表現が不正確になる可能性があるため、微生物DNAを抽出するには適切な方法論を使用する必要があります。フェノール-クロロホルム法がここに記載されているが、特定のケースでうまく機能する細菌からDNAを抽出するための市販のキットがあります¹¹。ただし、それらの使いやすさは、コストと必要なサンプル量によって制限されます。

ここで紹介するプロトコルは費用対効果が高く、少量のサンプルしか必要としません。あらゆる種類の便サンプルで問題なく機能し、時間の経過に伴う腸内細菌叢のダイナミクスの研究やグループ間の比較に役立ちます。DNAは、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを使用するアルコール精製法で単離されます。アルコールベースの抽出は、最終ステップでDNAが沈殿するタンパク質や脂質のサンプルを洗浄して除去するのに役立ちます。提案手法は、効率と品質が著しく高く、細菌集団の同定において正確であることが証明されています。手順中の重要な注意点の1つは、DNA汚染が発生する可能性があるため、適切なサンプルの取り扱いが必要であることです¹²。

次に、DNAは、イルミナMiSeqなどの16S rRNA遺伝子の次世代シーケンシングプラットフォームによって分析されます。特に、V4超可変領域は、高ランク分類群¹³のより良い定量化を提供するために分析されます。その後のバイオインフォマティクス解析は外部委託し、その後、標準的な統計手法を用いた社内解析を行います。ダウンストリームシーケンシングに利用できるオープンソースのバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムは多数あり、実行される分析の種類は、関心のある特定の生物学的問題に大きく依存します¹⁴。このプロトコルは、シーケンシング前の実験ステップに特に焦点を当てており、糞便サンプルからDNAを取得するためのより用途が広く、費用効果が高く、比較可能で効率的な方法を提供します。