Analyse van fecale microbiotadynamiek bij lupusgevoelige muizen met behulp van een eenvoudige, kosteneffectieve DNA-isolatiemethode

Mens en bacterie bestaan al heel lang naast elkaar. Ze hebben een codependente relatie opgebouwd met wederzijdse gunstige effecten die de immuunrespons van de gastheer op kwantitatieve en kwalitatieve manieren beïnvloedt¹. Recente studies suggereren een verband tussen de samenstelling van de darmmicrobiota en de pathogenese van auto-immuunziekten, waaronder multiple sclerose², reumatoïde artritis³, type 2 diabetes⁴, inflammatoire darmziekte⁵ en systemische lupus erythematosus (SLE)⁶. Of de darmmicrobiota de hoofdoorzaak of een secundair effect van deze auto-immuunziekten is, is echter nog onduidelijk⁷. Mogelijk kan de darmmicrobiota de ziekte verergeren tijdens de effectorfase van auto-immuunziekten of een rol spelen bij het reguleren van de inductie van deze ziekten⁸.

Intestinale dysbiose is gemeld bij vrouwelijke lupus-gevoelige MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) muizen, en darmmicrobiota veranderingen met een significante uitputting van Lactobacillen werden waargenomen⁹. Wanneer een mengsel van vijf Lactobacillus-stammen oraal werd toegediend, werden lupus-achtige symptomen bij deze muizen grotendeels verzwakt, wat wijst op een essentiële rol van microbiota bij het reguleren van SLE-pathogenese.

De volgende techniek van DNA-extractie maakt het mogelijk om microbiotafluctuaties te volgen en deze kwalitatief en kwantitatief te analyseren in de loop van murine SLE-achtige ziekte bij lupusgevoelige muizen. Of het nu gaat om het onderzoeken van de gezonde darmmicrobiota of het definiëren van dysbiose, het is belangrijk om kritisch te onderzoeken hoe gegevens worden verzameld en of deze nauwkeurig en reproduceerbaar zijn¹⁰. Elke stap is cruciaal in dit proces. Er moet een geschikte methodologie worden gebruikt om microbieel DNA te extraheren, omdat elk mogelijk probleem dat vooroordelen introduceert tijdens het DNA-extractieproces kan leiden tot onnauwkeurige microbiële representatie. Hoewel de fenol-chloroformmethode hier wordt beschreven, zijn er in de handel verkrijgbare kits om DNA te extraheren uit bacteriën die in bepaalde gevallen goed werken¹¹. Hun bruikbaarheid wordt echter beperkt door de kosten en de vereiste monsterhoeveelheid.

Het hier gepresenteerde protocol is kosteneffectief en vereist slechts een kleine hoeveelheid monster. Het werkt prima met elk soort ontlastingsmonster en is nuttig bij het bestuderen van de dynamiek van de darmmicrobiota in de loop van de tijd en vergelijkingen tussen groepen. DNA wordt geïsoleerd met een methode van alcoholzuivering, waarbij fenol, chloroform en isoamylalcohol worden gebruikt. Extractie op basis van alcohol helpt bij het reinigen en verwijderen van het monster van eiwitten en lipiden, waarbij DNA in de laatste stap wordt neergeslagen. De voorgestelde methode heeft een aanzienlijk hoge efficiëntie en kwaliteit en is bewezen nauwkeurig te zijn bij het identificeren van bacteriepopulaties. Een kritische noot tijdens de procedure is dat DNA-besmetting kan optreden, en dus is een passende monsterbehandeling vereist¹².

Het DNA wordt vervolgens geanalyseerd door de Next Generation Sequencing-platforms voor het 16S-rRNA-gen, zoals de Illumina MiSeq. In het bijzonder wordt het hypervariabele V4-gebied geanalyseerd om een betere kwantificering te bieden voor taxa¹³ met een hoge rang. De daaropvolgende bioinformatica-analyse wordt uitbesteed, gevolgd door interne analyse met behulp van standaard statistische methoden. Er zijn tal van open-source bioinformatica softwareprogramma’s beschikbaar voor downstream sequencing, en het type analyses dat wordt uitgevoerd, hangt sterk af van de specifieke biologische vraag van belang¹⁴. Dit protocol richt zich specifiek op de experimentele stappen voorafgaand aan sequencing en biedt een meer veelzijdige, kosteneffectieve, vergelijkbare en efficiënte methode om DNA uit fecale monsters te verkrijgen.