تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي لتحليل تغيرات ميكروبات الأمعاء الفئرانية أثناء تطور أمراض المناعة الذاتية.
Abstract
الميكروبات المعوية لها دور مهم في تثقيف الجهاز المناعي. هذه العلاقة مهمة للغاية لفهم أمراض المناعة الذاتية التي لا تحركها العوامل الوراثية فحسب ، بل أيضا العوامل البيئية التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور المرض و / أو تفاقم مسار المرض. أظهرت دراسة نشرت سابقا حول ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في الفئران الإناث المعرضة للذئبة MRL / lpr كيف يمكن للتغيرات في ميكروبات الأمعاء أن تغير تطور المرض. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاستخراج عينات تمثيلية من ميكروبات الأمعاء لدراسات المناعة الذاتية. يتم جمع عينات الميكروبات من فتحة الشرج ومعالجتها ، والتي يتم استخراج الحمض النووي منها باستخدام طريقة الفينول كلوروفورم وتنقيتها عن طريق هطول الأمطار الكحولية. بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم تسلسل الأمبليونات النقية باستخدام منصة تسلسل الجيل التالي في مختبر أرغون الوطني. أخيرا ، يتم تحليل بيانات تسلسل جين الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي 16S. على سبيل المثال ، يتم عرض البيانات التي تم الحصول عليها من مقارنات ميكروبات الأمعاء لفئران MRL / lpr مع أو بدون CX3CR1. أظهرت النتائج اختلافات كبيرة في الأجناس التي تحتوي على البكتيريا المسببة للأمراض مثل تلك الموجودة في فصيلة البروتيوباكتيريا ، وكذلك جنس Bifidobacterium ، الذي يعتبر جزءا من الميكروبات المصاحبة الصحية. باختصار ، هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي موثوقة ويمكن أن تساعد في التحقيق في تغيرات ميكروبات الأمعاء المرتبطة بأمراض المناعة الذاتية.
Introduction
لقد تعايش البشر والبكتيريا لفترة طويلة. لقد أقاموا علاقة اعتماد متبادل مع تأثيرات متبادلة المنفعة تؤثر على الاستجابات المناعية للمضيف بطرق كمية ونوعية1. تشير الدراسات الحديثة إلى وجود ارتباط بين تكوين ميكروبات الأمعاء والتسبب في أمراض المناعة الذاتية التي تشمل التصلب المتعدد 2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، ومرض السكري من النوع2 4 ، ومرض التهاب الأمعاء5 ، والذئبة الحمامية الجهازية (SLE)6. ومع ذلك ، ما إذا كانت ميكروبات الأمعاء هي السبب الرئيسي أو التأثير الثانوي لهذه الأمراض المناعية الذاتية لا يزال غير واضح7. من المحتمل أن تؤدي ميكروبات الأمعاء إلى تفاقم المرض خلال المرحلة المستجيبة لاضطرابات المناعة الذاتية أو تلعب دورا في تنظيم تحريض هذه الأمراض8.
تم الإبلاغ عن dysbiosis المعوية في الفئران MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) المعرضة للذئبة ، ولوحظت تغيرات ميكروبات الأمعاء مع استنفاد كبير من العصيات اللبنية9. عندما تم إعطاء خليط من خمس سلالات من Lactobacillus عن طريق الفم ، تم تخفيف الأعراض الشبيهة بالذئبة إلى حد كبير في هذه الفئران ، مما يشير إلى دور أساسي للميكروبات في تنظيم التسبب في مرض الذئبة الحمراء.
تسمح التقنية التالية لاستخراج الحمض النووي بمتابعة تقلبات الميكروبات وتحليلها نوعيا وكميا أثناء الإصابة بمرض يشبه الذئبة الحمراء الفئران في الفئران المعرضة للذئبة. سواء لفحص ميكروبات الأمعاء الصحية أو تعريف dysbiosis ، من المهم أن تدرس بشكل نقدي كيفية جمع البيانات وما إذا كانت دقيقة وقابلة للتكرار10. كل خطوة حاسمة في هذه العملية. يجب استخدام منهجية مناسبة لاستخراج الحمض النووي الميكروبي لأن أي مشكلة محتملة في إدخال تحيزات أثناء عملية استخراج الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى تمثيل ميكروبي غير دقيق. في حين يتم وصف طريقة الفينول كلوروفورم هنا ، هناك مجموعات متاحة تجاريا لاستخراج الحمض النووي من البكتيريا التي تعمل بشكل جيد في حالات معينة11. ومع ذلك ، فإن قابليتها للاستخدام محدودة بالتكلفة وكمية العينة المطلوبة.
البروتوكول المعروض هنا فعال من حيث التكلفة ولا يتطلب سوى كمية صغيرة من العينة. وهو يعمل بشكل جيد مع أي نوع من عينات البراز وهو مفيد في دراسة ديناميكيات ميكروبات الأمعاء بمرور الوقت وكذلك المقارنات بين المجموعات. يتم عزل الحمض النووي بطريقة تنقية الكحول ، والتي تستخدم الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل. يساعد الاستخراج القائم على الكحول على تنظيف وإزالة عينة البروتينات والدهون ، حيث يتم ترسيب الحمض النووي في الخطوة النهائية. تتميز الطريقة المقترحة بكفاءة وجودة عالية بشكل كبير وقد ثبت أنها دقيقة في تحديد مجموعات البكتيريا. إحدى الملاحظات الهامة أثناء الإجراء هي أن تلوث الحمض النووي يمكن أن يحدث ، وبالتالي يلزم التعامل مع العينات المناسبة12.
ثم يتم تحليل الحمض النووي بواسطة منصات تسلسل الجيل التالي لجين 16S rRNA ، مثل Illumina MiSeq. على وجه الخصوص ، يتم تحليل منطقة V4 فائقة التغير لتوفير تقدير كمي أفضل للأصناف عالية الرتبة13. يتم الاستعانة بمصادر خارجية لتحليل المعلوماتية الحيوية اللاحق ، يليه تحليل داخلي باستخدام الأساليب الإحصائية القياسية. هناك العديد من برامج المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر المتاحة للتسلسل النهائي ، ويعتمد نوع التحليلات التي يتم إجراؤها بشكل كبير على المسألة البيولوجية المحددة ذات الأهمية14. يركز هذا البروتوكول بشكل خاص على الخطوات التجريبية قبل التسلسل ويوفر طريقة أكثر تنوعا وفعالية من حيث التكلفة وقابلة للمقارنة وفعالة للحصول على الحمض النووي من عينات البراز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن للميكروبات المعوية المتوازنة حماية جسم الإنسان من الأمراض. بمجرد أن يتعطل هذا التوازن بسبب المحفزات الخارجية أو الداخلية ، يمكن أن تكون العواقب مدمرة. تقدم هذه الطريقة طريقة لتحليل ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في نماذج الفئران. هذه الطريقة مناسبة ليس فقط للمقارنات بين المجموعات ولك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر المساعدة المقدمة من مختبر أرغون الوطني وأخصائيي المعلوماتية الحيوية المتعاونين معنا. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
