3Dプリンティングとエレクトロスピニングを組み合わせて、生体模倣心臓弁リーフレットを製造

1. 準備作業 3Dプリンティング注: 以下の手順では、この原稿で補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル 4、および補足ファイル5として提供されている「標準三角形言語」(STL) ファイル をダウンロードする必要があります。コレクタ パーツは STL ファイルとして提供されます。接続フランジは「製品モデルデータの交換のためのSTandard」(STEP)ファイルとして提供され、個々のセットアップに合わせてコレクタを調整できます。さらに、中央金属棒の技術図面は、 補足ファイル6として従来の製造のために提供されている。 スライスソフトウェア( 材料表を参照)を開き、非導電性ポリ乳酸(PLA)と0.4mmノズル用のアクティブプリントヘッドを構成します。メモ: スライシングソフトウェア、フィラメント、ノズルの直径は、使用可能な 3D プリンタによって異なる場合があります。 STLファイル Specimen_mount_A(補足ファイル3) と Speciment_mount_B(補足ファイル4) をスライスソフトウェアにアップロードします。 モデルを回転させて、三角形のサーフェスがビルドプレートに配置されるようにします。 すべての部品にマークを付け、右クリックして「選択したモデルを乗算」を選択します。プロンプトの「コピー数」に「1」と入力し、「OK」をクリックします。合計 4 つのモデルをビルド プレートに配置します。 スライスの厚さを 0.1 mm、壁の厚さを 1 mm、インフィル密度を 40% に設定し、[ サポートを生成] ボックスのチェックを外します。 スライスボタン|[リムーバブルに保存] を選択すると、印刷ファイルが USB ドライブに保存されます。 非導電性PLAをプリンタにロードし、印刷ファイルを起動します。 印刷が完了したら、ビルドプレートからモデルを取り出し、下隅に反りがないか確認します。 スライスソフトウェアで、材料パラメータを保持し、モデルを Collector_Flange(補足ファイル1 および 補足ファイル5) および Leaflet_Template(補足ファイル2)に置き換えます。 フランジを回転させて、平らな円形のサーフェスがビルドプレートに当たるようにします。さらに、リーフレットテンプレートを回転させて、正方形の表面がビルドプレートに直接配置されるようにします。 フランジにマークを付け、ステップ 1.1.4 のようにモデルを乗算します。「1 」 と入力すると、構築プレート上のフランジモデルのコピー 1 個 とオリジナル 1 個を受け取ります。 リーフレット モデルにマークを付け、 8 を掛けると、1.1.4 で説明されている手順に従って、合計 9 つのリーフレット モデルを受け取ります。 スライスの厚さを 0.1 mm、壁の厚さを 1 mm、インフィル密度を 80% に設定し、[サポートを生成]ボックスのチェックを外します。 スライスボタン|[リムーバブルに保存] を選択すると、新しい印刷ファイルが USB ドライブに保存されます。 導電性PLAをプリンタにロードし、印刷プロセスを開始します。 印刷が完了したら、ビルド プレートからモデルを取り出します。リーフレットネガティブの底部にある個々のフィラメント繊維がリーフレットモデルに存在する場合は、ワイヤーカッターで慎重に取り除きます(サポート構造が使用されていないため)。 紡糸原液注意:テトラヒドロフラン(THF)およびジメチルホルムアミド(DMF)は有害な溶媒であり、吸入したり皮膚に接触させたりしないでください。耐溶剤性の手袋と保護ゴーグルの取り扱い中は、着用することを強くお勧めします。それらを扱うときは、非常に揮発性であるため、排気フードの下で作業してください。 排気フードの下にスケールを置き、その上に200 mLのスクリューキャップガラス瓶を置きます。スケールを風袋にする。 50 mL の DMF と 50 mL の THF をガラス瓶に注ぎます。なお、溶媒の重量。 ボトル内に磁気バーを置き、ボトルをマグネチックスターラーの上に置き、スイッチを入れます。 注記された重量に0.15(= 15% w/v)を掛け、対応する量のポリウレタン(PU)を溶媒混合物(DIN 1310)の入ったガラス瓶にゆっくりと移す。 ボトルを閉じ、室温で少なくとも12時間攪拌して、均一な溶液を得る。 2. エレクトロスピニングのセットアップ 集会注:提示されたコレクターで作成されたリーフレット足場は比較的小さいため、大口径ドラムマンドレル(D:110 mm)をオプションで使用することをお勧めします。これにより、より大きく多層の足場の作成が可能になり、顕微鏡的、生体適合性、および生体力学的評価に有益である。 3D プリント部品と 6 本の M3 x 15 ネジを使用してコレクタを組み立てます。 3 本のネジを使用して、金属棒をフランジの 1 つに固定します。 金属製のバーの間に 1 本の Specimen_mount_B をスライドさせます。テンプレートのスペースがフランジの反対方向を向いていることを確認します。 Specimen_mount_Bの3つのスロットに心臓弁リーフレットテンプレートを埋めます。 Specimen_mount_Aを上に置き、スペースをテンプレートで埋めます。 別の Specimen_mount_A をスライドさせ、スペースにテンプレートを入力します。 テンプレートを固定するには、2 番目の Specimen_mount_B を一番上に置きます。 2 番目のフランジを上に置き、M3 ネジを使用して固定します。メモ: リーフレットテンプレートがすべて同じ方向(リーフレットの直線エッジが金属棒に平行)に向いていることを確認します。 組み立てたリーフレットコレクタをエレクトロスピニングセットアップに置き、フランジをモーター軸(M6ネジとウィングナットなど)にしっかりと固定します(図1)。警告: 導電性の PLA は通常の PLA よりも脆いため、カチッと音がしないように、材料に圧力をかけるボルトを締めるときは、1.4 Nm のトルクレンチを使用してください。 針ホルダーをコレクターから30cm離して置きます。 針ホルダーに平らな先端を持つ14ゲージ(G)の針を固定し、コレクターの軸の高さに固定します。 柔軟で耐溶剤性(例えば、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE))チューブを針のルアーロックポートに接続します。注:DMFおよびTHFは多くのプラスチックを溶解します。これらの溶剤を扱うときは、耐溶剤性材料、例えば金属やガラス工具を使用する必要があります。プラスチック製の工具(シリンジやチューブなど)が必要な場合は、耐溶剤性の材料を使用してください。 チューブをシリンジポンプに導き、後でポリマー充填シリンジを接続します。 電源機構装置 (PSU) の接続警告: セットアップ中は、電源装置が主電源から外されていることを確認してください。 2本のシールド付き高電圧ケーブルを電源のアノードとカソードに接続します。 ワニクリップを使用して、カソード(-ポール)に接続されたケーブルを14Gニードルに接続します。クリップと針の接続を確認します。次に、干渉を避けるために、高電圧ケーブルが回転領域の外側に流れるようにガイドします。 クロコダイルクリップと2本目の高圧ケーブルを使用してコレクタをアノード(+ポール)に接続します。スリップリングまたはスリップケーブルを使用したスライド接点を使用して、コレクターのフランジに接触を作成します。 シリンジの調製メモ: この手順は、紡績プロセスが開始される直前に実行する必要があります。 20 mL のルアーロックシリンジに、ステップ 1.2 で調製した紡糸溶液を充填します。 シリンジを耐溶剤性チューブに接続し、針の先端に液滴が見えるまで溶液を手動でチューブシステムに押し込みます。 シリンジをシリンジポンプに入れます。ポンプの電源を入れた後、次のパラメータを入力します: 直径:19.129 mm。 容量:5ミリリットル; 速度3キロ/時。 3. エレクトロスピニングプロセス モーターテスト走行メモ: 3D プリントを使用してコレクターを製造すると、コレクターの中心から外れた動きが発生する可能性があります。したがって、低回転速度で高電圧なしでテスト走行することを強くお勧めします。 コンピュータのアイコンをダブルクリックして、モータ制御ソフトウェアを開きます。 [接続] ボタンをクリックして、モーター コントロール に接続します 。 接続後、 プロファイル速度 操作モードを選択し、画面の左上隅にある [操作 ]タブをクリックします。 赤い線で囲まれたクイックストップボタンの下にある[プロファイル速度]タブを選択します。次の設定を入力します: 目標速度: 200 rpm;プロファイル加速度:100;プロファイル減速:200;クイックストップ:5000。メモ: 回転方向は針側で上向きにする必要があり、「目標速度」フィールドの記号を「+」から「-」に変更することで調整できます。 テスト実行を開始し、コレクタにアンバランスがないか確認します。コレクターがスムーズに実行される場合は、プロトコルに進みます。それ以外の場合は、モーターを停止し、ステップ 2.1.9 の説明に従ってコレクターを再調整します。 スイッチオン有効ボタンをクリックしてモーターを停止し、目標速度を2,000rpmに変更します。 製造プロセス注:エレクトロスピニングは、環境パラメータに大きく依存するプロセスです。最適な電界紡糸結果は、21〜24°Cの温度で15〜20%の相対湿度の間で得られた。最初のレイヤーメモ:セットアップ段階で、PUの乾燥した液滴が針の先端に形成された可能性があります。必要に応じて、長い非導電性ツールを使用して液滴を取り外します。 モータ制御ソフトウェアで、[ 操作を有効にする] ボタンをクリックしてモータの電源を入れます。 高電圧電源をオンにし、アノードとカソードの両方の電圧を調整します:マイナス極(針):18 kV。プラスポール(コレクタ):1.5キロバイト。 シリンジポンプを3mL/hの流量で始動します。 タイマーを 20 分に設定します。 テーラーコーンの形成のために針先を観察します。針先のコーンの形状に応じて、安定したテーラーコーンが確立されるまで、カソードでの電圧を±100V刻みで調整します。メモ: ドロップがハングしている場合、電圧は低すぎます。ただし、非定常的な流れは、電圧の設定が高すぎることを示している可能性があります。 カスプテンプレートが繊維で十分に覆われるまで20分間待ちます。 シリンジポンプの電源を切ります。 電源スイッチを反転して、PSU の電源をオフにします。 モーター制御ソフトウェアの [ オンに切り替え] ボタンをクリックして、モーターを停止します。警告: システム内の可動部品による怪我を防ぐため、コレクタが完全に停止するまで待って試験チャンバを開いてください。 第2層 モータ制御ソフトウェアで、入力フィールドの ターゲット速度を10rpm に変更します。 手順 3.2.1.1-3.2.1.9 を繰り返します。 第3層注:足場が完全に乾く前に、足場は機械的ストレスに非常に敏感です。ステップ 3.2.3.2-3.2.3.6 を実行するときは、十分に注意してください。これらの手順では、足場が役に立たなくなる可能性があるため、足場/繊維に触れないでください。 コレクタフランジをモータ軸に接続するネジを慎重に開き、チラシコレクタ(図2B)をエレクトロスピニング装置から取り外します。 メスを使用して、各リーフレットテンプレートの外側の輪郭に沿ってエレクトロスピニングされた繊維を切断する(図2C)。 コレクターの片側にあるフランジを取り外します。 3D プリントされたインサートを引き出し、リーフレットテンプレートを非導電性の三角形ホルダーから分離します。 すべてのリーフレットテンプレートを 90° 回転させ、コレクターを組み立て直します。 コレクタをエレクトロスピニングセットアップに挿入し、しっかりと固定します。 繰り返しますが、紡績プロセスを続行する前に、アンバランスがないか確認してください。 モータ制御ソフトウェアで、入力フィールドの ターゲット速度 を 2,000 rpm に変更します。 手順 3.2.1.1-3.2.1.9 を繰り返します。注:エレクトロスピニングプロセスを完了した後、チューブの目詰まりを防ぐために、チューブと針を純粋なDMFで洗い流すことを強くお勧めします。 蛍光染色足場(オプション)注:蛍光染料は、従来の蛍光顕微鏡下で繊維を見えるようにするために使用されます。これは、メソッドの実装中および新しい設定が適用された後の品質管理にのみ必要です。確立された設定を使用して足場を製造する場合、蛍光色素の使用は推奨されません。 ステップ1.2で調製した紡糸原液を別々のボトルに3等分に分割する。 スケールを使用して、ポリマー溶液のグラム(0.1重量%)ごとに1mgの蛍光色素を測定する。3つの蛍光色素(すなわち、フルオレセイン、テキサスレッド、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール[DAPI])について繰り返します。 紡糸溶液に染料を加え、ボトルの蓋を閉め、2〜3時間または均質化するまで攪拌する。注:蛍光染料が退色するのを防ぐために、マグネチックスターラーの上に不透明なカバーを置くことによって、紡糸溶液をできるだけ光から保護してください。蛍光染色足場のプロセスは、ステップ3.2.1-3.2.3で説明されている標準的なプロセスと非常によく似ています。 ステップ3.2.1で、標準シリンジを、第1の蛍光色素を含む紡糸溶液で満たされたシリンジと交換する。 ステップ 3.2.2 で、現在使用されているチューブと針を、新しいチューブと針またはクリーニング済みのチューブと針と交換します。続いて、第2の蛍光色素を含む紡糸原液を入れたシリンジをシリンジポンプに入れる。 ステップ3.2.3で再度、チューブと針を新しいものまたは洗浄したものと交換し、シリンジを3番目の蛍光色素を含む紡糸溶液で満たされたものと交換します。注:製造プロセス中の遅延を避けるために、3組のチューブと針を使用することは有益です。あるいは、チューブおよび針を、蛍光色素を含む紡糸溶液が系内に残らなくなるまで、層の製造の間にTHFおよびDMFで完全にフラッシュすることができる。 4. 後処理とサンプル取得 後処理スキャフォールド 電界紡糸装置からコレクタを取り外します。 メスを使用して、ステップ 3.2.3.2 の説明に従って、各テンプレートをその基部で自由に切り取ります。 上記のようにコレクターを開き、テンプレートをベースにしてトレイに置きます。 トレイを乾燥キャビネットに入れ、40°Cで一晩置く。 サンプルが完全に乾燥したら、メスを使用してリーフレットテンプレートの端に沿って慎重に切断し、余分な繊維を除去します。 その後、テンプレートのリーフレット足場を慎重に剥がし、さらなる処理のためにトレイの上に置きます。