结合3D打印和静电纺丝来制造仿生心脏瓣膜传单

1. 准备工作 3D打印注意：以下步骤需要下载随本手稿一起提供的“标准三角形语言”（STL） 文件，这些文件作为 补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4 和 补充文件 5 提供。收集器零件以 STL 文件的形式提供。连接法兰以“用于交换产品模型数据的STandard”（STEP）文件的形式提供，以允许调整收集器以适应各个设置。此外，中央金属棒的技术图纸作为 补充文件6提供用于常规制造。 打开切片软件（参见 材料表），为非导电聚乳酸 （PLA） 和 0.4 mm 喷嘴配置有源打印头。注意：切片软件、灯丝和喷嘴直径可能因可用的 3D 打印机而异。 将 STL 文件 Specimen_mount_A（补充文件 3） 和 Speciment_mount_B（补充文件 4） 上传到切片软件中。 旋转模型，以便将三角形曲面放置在构建板上。 标记所有零件，单击鼠标右键，然后选择“乘以所选模型”。在提示的份数中输入 1，然后单击确定。在构建板上放置总共四个模型。 将切片厚度设置为 0.1 mm，壁厚设置为 1 mm，将填充密度设置为 40%，然后取消选中 生成支撑 框。 单击切片按钮|保存到“可移动”以将打印文件保存到 USB 驱动器。 将非导电 PLA 装入打印机并启动打印文件。 打印完成后，从构建板上取下模型，并检查底部角落的翘曲。 在切片软件中，保留材料参数，并将模型替换为Collector_Flange（补充文件1和补充文件5）和Leaflet_Template（补充文件2）。 旋转法兰，使平坦的圆形表面靠在构建板上。此外，旋转传单模板，以便将方形表面直接放置在构建板上。 标记法兰并将模型相乘，如步骤 1.1.4 所示。键入 1 以接收构建板上法兰模型的 1 份副本和 1 份原 件。 按照 1.1.4 中描述的步骤，标记传单模型并乘以 8 以接收总共 9 个传单模型。 将 切片厚度 设置为 0.1 mm，壁厚 设置为 1 mm，填充密度 设置为 80%，然后取消选中 生成支撑 框。 单击切片按钮|保存到可移动以将新的打印文件保存到 USB 驱动器。 将导电 PLA 装入打印机并开始打印过程。 打印完成后，从构建板中取出模型。如果小叶型号中存在，请用线切割器小心地去除小叶底部的单个灯丝纤维（因为未使用支撑结构）。 纺纱解决方案注意：四氢呋喃（THF）和二甲基甲酰胺（DMF）是有害溶剂，不应吸入或接触皮肤。强烈建议在处理时戴上耐溶剂手套和护目镜。在处理它们时，请在排气罩下工作，因为它们非常不稳定。 在排气罩下放置一个秤，并在其上放置一个 200 mL 螺旋盖玻璃瓶。去皮量表。 将50毫升DMF和50毫升THF倒入玻璃瓶中。注意溶剂的重量。 在瓶子内放置一个磁棒，将瓶子放在磁力搅拌器上，然后将其打开。 将记示的重量乘以0.15（= 15%w / v），并将相应量的聚氨酯（PU）缓慢转移到含有溶剂混合物（DIN 1310）的玻璃瓶中。 关闭瓶子并在室温下搅拌至少12小时以获得均质溶液。 2. 静电纺丝设置 集会注意：由于使用所呈现的收集器创建的传单脚手架相对较小，因此建议选择使用大直径滚筒心轴（D：110 mm）。这允许创建更大的多层支架，这将有利于微观，生物相容性和生物力学评估。 使用 3D 打印部件和六个 M3 x 15 螺钉组装收集器。 使用三个螺钉将金属棒固定在其中一个法兰上。 在金属棒之间滑动一 Specimen_mount_B 。确保模板的空间指向法兰的相反方向。 用心脏瓣膜小叶模板填充 Specimen_mount_B 的三个插槽。 将 Specimen_mount_A 放在顶部，并用模板填充空间。 将另一个 Specimen_mount_A 滑入并用模板填充空间。 通过将第二 个Specimen_mount_B 放在顶部来固定模板。 将第二个法兰放在顶部，然后使用M3螺钉将其固定。注：确保小叶模板的方向都朝同一方向（小叶的直边平行于金属棒）。 将组装好的传单收集器置于静电纺丝装置中，并将法兰紧紧地固定在电机轴上（即M6螺钉和翼形螺母）上（图1）。注意：由于导电 PLA 比普通 PLA 更脆，因此在紧固对材料施加压力的螺栓时，请使用 1.4 Nm 的扭矩扳手，以避免折断。 将针架放在离收集器 30 厘米的位置。 将一个14号（G）的针头固定在针座上，用扁平的尖端将其固定在收集器轴的高度。 将柔性、耐溶剂（例如聚四氟乙烯 （PTFE））管连接到针的鲁尔锁定端口。注意：DMF和THF可溶解许多塑料。在使用这些溶剂（例如金属和玻璃工具）时，必须使用耐溶剂材料。当需要塑料工具（即注射器或管道）时，请确保使用耐溶剂材料。 将管子引导至注射器泵，以便以后连接聚合物填充的注射器。 电源单元 （PSU） 的连接注意：在设置过程中，请确保电源已与主电源断开连接。 将两根屏蔽高压电缆连接到电源的阳极和阴极。 使用鳄鱼夹，将连接到阴极（-杆）的电缆连接到14 G针。检查夹子和针头之间的连接。接下来，引导高压电缆，使其在旋转区域外运行，以避免干扰。 使用鳄鱼夹和第二根高压电缆将集电极连接到阳极（+极）。使用滑环或滑动触点，使用剥离电缆在收集器的法兰处形成接触。 注射器的准备注意：此步骤应在纺纱过程开始之前立即执行。 用步骤1.2中制备的纺丝溶液填充20 mL鲁尔锁定注射器。 将注射器连接到耐溶剂管，并手动将溶液推入管路系统中，直到针尖处可见液滴。 将注射器放入注射器泵中。打开泵后，输入以下参数： 直径：19.129 mm; 容量： 5 毫升; 速度 3 毫升/小时。 3. 静电纺丝工艺 电机试运行注意：使用 3D 打印制造收集器可能会导致收集器偏离中心运动。因此，强烈建议以较低的转速运行，但没有高电压。 通过双击计算机上的图标打开电机控制软件。 通过单击“ 连接 ”按钮连接到电机控件。 连接后，选择 “配置文件速度 ”操作模式，然后单击位于屏幕左上角的“ 操作 ”选项卡。 选择由红线框住的快速停止按钮下方的“轮廓速度”选项卡。输入以下设置： 目标速度： 200 rpm;轮廓加速度：100;型材减速： 200;快速停止：5000。注意：指针侧的旋转方向应朝上，可以通过将“目标速度”字段中的符号从“+”更改为“-”来调整。 开始测试运行并检查收集器是否存在任何不平衡。如果收集器运行平稳，请继续执行协议。否则，请停止电机并按照步骤2.1.9中所述重新调整收集器。 通过单击 启用开关 按钮停止电机，并将 目标速度 更改为 2，000 rpm。 制造工艺注：静电纺丝是一种对环境参数高度依赖的过程。在21至24°C的温度下，相对湿度在15-20%之间获得最佳的静电纺丝结果。第一层注意：在设置阶段，可能在针尖形成了一滴干燥的PU液滴。如有必要，使用长而非导电的工具去除液滴。 在电机控制软件中，单击 启用操作 按钮以打开电机。 打开高压电源，调整阳极和阴极的电压：负极（针）：18 kV;加极（集电极）：1.5千伏。 以 3 mL/h 的流速启动注射泵。 将计时器设置为 20 分钟。 观察针尖形成裁缝锥体。根据针尖锥体的形状，以±100 V的增量调整阴极的电压，直到建立稳定的定制锥体。注：如果压降挂起，则电压过低。然而，不稳定的流动可能表明电压设置得太高。 等待20分钟，让尖点模板被纤维充分覆盖。 关闭注射泵。 通过翻转电源开关关闭 PSU。 通过单击电机控制软件中的 “打开启用 ”按钮停止电机。注意：为防止系统中移动部件造成伤害，请等到收集器完全停止后再打开测试室。 第二层 在电机控制软件中，将输入字段 目标速度 更改为 10 rpm。 重复步骤 3.2.1.1-3.2.1.9。 第三层注意：在脚手架完全干燥之前，它们对机械应力非常敏感。执行步骤 3.2.3.2-3.2.3.6 时要非常小心。在这些步骤中避免触摸支架/纤维，因为支架可能会变得无用。 小心地打开将收集器法兰连接到电机轴的螺钉，然后从静电纺丝装置上取下小叶收集器（图2B）。 使用手术刀，沿着每个小叶模板的外轮廓切割电纺纤维（图2C）。 卸下收集器一侧的法兰。 拉出3D打印的插入物，并将传单模板与非导电三角形支架分开。 将所有传单模板旋转 90°，然后重新组装收集器。 将收集器插入静电纺丝装置并紧紧固定。 同样，在继续旋转过程之前，请检查是否有任何不平衡。 在电机控制软件中，将输入字段 目标速度 更改为 2，000 rpm。 重复步骤 3.2.1.1-3.2.1.9。注意：完成静电纺丝过程后，强烈建议使用纯DMF冲洗管子和针头，以防止管子堵塞。 荧光染色支架（可选）注意：荧光染料用于使纤维在常规荧光显微镜下可见。这仅在实现方法和应用新设置后的质量控制时才需要。在使用既定设置制造支架时，不建议使用荧光染料。 将步骤1.2中制备的纺丝溶液分成三个相等的份，装在单独的瓶子中。 使用秤，测量每克（0.1重量%）聚合物溶液1mg荧光染料。对所有三种荧光染料（即荧光素，德克萨斯红，4’，6-二脒-2-苯基吲哚[DAPI]）重复上述步骤。 将染料加入纺丝溶液中，关闭瓶盖，搅拌2-3小时或直到均质化。注意：为了防止荧光染料褪色，请尽可能保护纺丝溶液免受光照，即通过在磁力搅拌器上放置不透明的盖子。荧光染色支架的工艺与步骤3.2.1-3.2.3中描述的标准工艺非常相似。 在步骤3.2.1中，用装有含有第一荧光染料的纺丝溶液的注射器替换标准注射器。 在步骤3.2.2中，用新的或清洁过的管子和针头替换当前使用的管材和针头。随后，将装有含有第二种荧光染料的纺丝溶液的注射器置于注射器泵中。 再次在步骤3.2.3中，用新的或清洁过的管子和针头替换管子和针头，并用装有含有第三种荧光染料的纺丝溶液的注射器替换注射器。注：为避免制造过程中的延误，最好使用三套管材和针头。或者，可以在生产层之间用THF和DMF彻底冲洗管和针，直到系统中没有残留含有荧光染料的纺丝溶液。 4. 后处理和样品采集 后处理脚手架 从静电纺丝装置上取下收集器。 使用手术刀，按照步骤3.2.3.2中所述，在其底部免费切割每个模板。 如上所述，打开收集器，然后将模板放在托盘上。 将托盘放在干燥柜中在40°C下过夜。 样品完全干燥后，用手术刀沿着传单模板的边缘小心地切割，以除去多余的纤维。 然后，小心地剥离模板的小叶支架，并将其放在托盘上进行进一步处理。