Этот протокол описывает подход к обработке изображений на основе iSCAT и отслеживанию одной частицы, который позволяет одновременно исследовать молекулярную массу и диффузное поведение макромолекул, взаимодействующих с липидными мембранами. Пошаговые инструкции по подготовке образцов, преобразованию массы в контраст, получению фильмов и постобработке приведены вместе с инструкциями по предотвращению потенциальных ловушек.
Кратковременные или переходные взаимодействия макромолекул на липидных мембранах и с ними, интерфейс, где происходит множество существенных биологических реакций, по своей природе трудно оценить стандартными биофизическими методами. Внедрение массочувствительного отслеживания частиц (MSPT) представляет собой важный шаг на пути к тщательной количественной характеристике таких процессов. Технически это стало возможным благодаря появлению интерферометрической рассеивающей микроскопии (iSCAT) на основе массовой фотометрии (MP). Когда стратегия удаления фона оптимизирована для выявления двумерного движения частиц, связанных с мембраной, этот метод позволяет в режиме реального времени анализировать как диффузию, так и молекулярную массу немаркированных макромолекул на биологических мембранах. Здесь описан подробный протокол выполнения и анализа массочувствительного отслеживания частиц мембранно-ассоциированных систем. Измерения, выполняемые на коммерческом массовом фотометре, достигают временного разрешения в миллисекундном режиме и, в зависимости от системы MP, предела обнаружения массы до 50 кДа. Чтобы продемонстрировать потенциал MSPT для углубленного анализа динамики макромолекул, катализируемых мембраной в целом, представлены результаты, полученные для образцовых белковых систем, таких как нативный мембранный интеракторный аннексин V.
Когда-то просто воспринимаемые как барьер против широкого спектра физических условий окружающей среды, биологические мембраны в настоящее время считаются функциональными сущностями и каталитическими платформами 1,2. Основываясь на своей способности локализовать, усиливать и направлять сигналы в ответ на мембранно-ассоциированные макромолекулярные реакции, липидные интерфейсы представляют собой важнейший элемент для широкого спектра клеточных процессов, таких как мембранный трафик и сигнальные каскады 3,4,5. Служа местом зарождения для сборки стабильных комплексов, прикрепление мембраны часто опирается на динамическое равновесие между мембраноассоциированной и цитозольной формами макромолекул и, следовательно, имеет переходную природу 6,7.
Несмотря на их большое значение в биологии, до сих пор было сложно разработать методы, которые могут обеспечить доступ к композиционным, пространственным и временным неоднородностям мембранно-ассоциированных макромолекулных реакций в режиме реального времени 7,8. Для разрешения лежащих в основе молекулярных процессов решающее значение имеют два экспериментальных аспекта: достаточное разрешение по времени и чувствительность к одной частице. Таким образом, методы ансамблевого среднего уровня, такие как восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP), а также гораздо более чувствительная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), имеют ограничения, поскольку они в значительной степени отделяют пространственную информацию от временной информации9. Таким образом, важным шагом на пути к характеристике динамики отдельных молекул стало появление отслеживания одной частицы (SPT) в сочетании с высокочувствительной микроскопией. В частности, два подхода ППП доказали свою эффективность в этом отношении. Во-первых, использование флуорофоров в качестве меток и соответствующих систем обнаружения флуоресценции проложило путь к нанометровой точности и миллисекундному временному разрешению 10,11,12. Во-вторых, обнаружение на основе рассеяния с использованием наночастиц золота улучшило как точность локализации, так и временное разрешение до субнанометрового и микросекундного диапазона соответственно 13,14,15,16. Несмотря на многочисленные преимущества обоих подходов и их значительный вклад в механистическое понимание мембраноассоциированных систем17,18, оба метода до сих пор были ограничены: они требуют маркировки интересующих молекул, что потенциально нарушает их собственное поведение и нечувствительно к молекулярному составу мембраноассоциированных частиц19,20.
Оба эти ограничения были недавно преодолены введением нового подхода на основе интерферометрического рассеяния (iSCAT), называемого массовой фотометрией (MP)21,22,23. Этот метод позволяет определить распределение массы биомолекул в растворе в соответствии с их контрастностью iSCAT при посадке на стеклянную границу. Однако для обнаружения и характеристики подвижных молекул, диффундирующих на липидных мембранах, необходимо было разработать более сложный подход к анализу изображений. Это тем временем успешно реализовано и позволяет обнаруживать, отслеживать и определять молекулярную массу одиночных немаркированных биомолекул, диффундирующих на липидном интерфейсе24,25. Этот метод, называемый динамической массовой фотометрией или массочувствительным отслеживанием частиц (MSPT), теперь позволяет оценивать сложные макромолекулярные взаимодействия путем непосредственной регистрации изменений молекулярной массы отслеживаемых объектов и, следовательно, открывает новые возможности для механистического анализа молекулярной динамики, связанной с мембраной.
Здесь представлен подробный протокол подготовки образцов, визуализации и конвейера анализа данных, необходимых для MSPT. В частности, обсуждаются требования к образцам и потенциальные проблемы, которые могут возникнуть во время измерения и анализа. Кроме того, беспрецедентный потенциал для анализа мембранно-взаимодействующих макромолекулярных систем демонстрируется различными репрезентативными результатами.
Представленный протокол расширяет массовую фотометрию21, метод, который анализирует массу одиночных биомолекул, адсорбирующих на стекле, до еще более универсального инструмента, способного одновременно измерять массу и диффузию немаркированных мембранно-взаимодействующих биомолекул. Это расширение анализа достигается за счет реализации модифицированной стратегии удаления фона, адаптированной к боковому движению молекул24,25. В целом, удаление фона имеет первостепенное значение для подходов, основанных на iSCAT, поскольку сильное рассеяние шероховатости поверхности стекла представляет собой основное препятствие для анализа, а точное определение локального фона каждого пикселя имеет важное значение для количественной оценки массы и местоположения частиц. Помимо анализа изображений, адаптированного к движению частиц, последующее обнаружение частиц, связывание траекторий и анализ данных завершают новое расширение MP в массочувствительное отслеживание частиц (MSPT).
В целом, тщательно очищенные слайды стеклянной крышки и чистая рабочая среда являются критическими требованиями для успешного проведения экспериментов MSPT. Из-за отсутствия маркировки макромолекул приобретенный сигнал по своей сути является неселективным. Таким образом, чистые образцы, а также надлежащая обработка образцов имеют решающее значение для обеспечения того, чтобы наблюдения не могли быть неправильно истолкованы. В частности, при исследовании молекул с низкой молекулярной массой подтверждаются контрольные измерения безбелковых мембран для оценки фоновых вкладов (дополнительный рисунок 1). Помимо включения контрольных измерений, поэтому рекомендуется следовать этапам подготовки, показанным на рисунке 2 для каждой проточной камеры. В сочетании эти меры безопасности гарантируют, что обнаруженный сигнал исходит от биомолекулы, представляющей интерес, а не, например, из загрязненной проточной камеры, буфера или мембраны.
Помимо мер предосторожности в отношении экспериментального проектирования, необходимо также соблюдать осторожность во время обработки изображений MSPT. Во время обработки видео значение для трех параметров должно быть тщательно выбрано, чтобы обеспечить правильные результаты: i) длина медианного окна для удаления фона, ii) порог для обнаружения частиц и iii) максимальный радиус поиска во время назначения ссылки. Большее медианное окно (i) обычно облегчает отделение диффузионных частиц от наложенного квазипостоянного фона. Однако для слишком больших размеров окон дрейф выборки в конечном итоге станет заметным и снизит точность фоновой оценки. Оптимальные настройки в значительной степени зависят от свойств образца и условий измерения. Тем не менее, значение 1001 может быть использовано в качестве надежной отправной точки. Пороговый параметр (ii) должен быть настроен в зависимости от наименьшей молекулярной массы, ожидаемой в образце. Значение ниже 0,0005 не рекомендуется для измерений, проводимых с помощью массового фотометра, используемого в этом исследовании. Чтобы ускорить время анализа, можно выбрать более высокие значения, если ожидается образец с высокой молекулярной массой. Радиус поиска в связывании траектории (iii) определяет максимальное радиальное расстояние в пикселях, в котором смещенное местоположение частицы будет искаться в последовательных кадрах. Он должен быть адаптирован к самой быстрой частице в образце, и, если это предпочтительно, адаптивный диапазон поиска (см. документацию trackpy) может быть использован вместо этого для сокращения времени вычислений. Особенно на начальном этапе проекта рекомендуется повторный анализ фильмов с различными параметрами для проверки полученных результатов.
В свете одномолекулярной природы MSPT следует избегать измерения при высокой плотности мембранных частиц, поскольку они могут мешать точному определению контраста и массы. Было показано, что плотности ниже одной частицы на квадратный микрометр благоприятны для измерений MSPT24. Дополнительным соображением являются ожидаемые коэффициенты диффузии в выборке. Хотя MSPT применим к широкому диапазону коэффициентов диффузии, он имеет нижний предел доступных коэффициентов диффузии. Локальное ограничение областью в несколько пикселей в течение значительной части периода среднего окна объединяет частицу со статическим фоном. Для условий визуализации, используемых в этом протоколе, измерение коэффициентов диффузии ниже 0,01 мкм2/с не рекомендуется. При такой скорости диффузии, например, среднее квадратическое смещение частицы во время среднего полуразмера окна составляет около 4 пикселей и, следовательно, имеет такой же размер, как и протяженность PSF. Как следствие, оценка статического фона, вероятно, будет содержать вклад сигнала от самой частицы, что приводит к, по-видимому, снижению контрастности частицы до тех пор, пока она в конечном итоге не приблизится к уровню шума. Однако коэффициенты диффузии макромолекул в диапазоне от 0,05 до 10 мкм2/с могут быть четко разрешены.
Чтобы еще больше расширить диапазон приложений MSPT, можно представить себе продвижение фонового алгоритма на основе медианы путем устранения пикселей, которые временно заняты частицей, или путем коррекции дрейфа выборки, позволяющей увеличить медианные размеры окна. Оба подхода облегчили бы проблемы, связанные с измерениями при высокой плотности частиц и медленной диффузии. Улучшения с точки зрения более низкой массовой чувствительности находятся на горизонте с новым поколением массовых фотометров, которые могут обеспечить доступ к биомолекулам размером менее 50 кДа. Таким образом, будущие эксперименты MSPT смогут изучать динамику одной молекулы и взаимодействия, связанные с мембраной, для еще более широкого спектра мембранных мимикрий, таких как мягкие бислои и макромолекулярные системы.
The authors have nothing to disclose.
Мы искренне ценим поддержку филиппа Кукуры, Гэвина Янга и команды разработчиков программного обеспечения Refeyn и признаем их помощь, делясь частями кода анализа изображений. Мы благодарим Cryo-EM MPIB Core Facility за предоставление доступа к коммерческому массовому фотометру Refeyn. F.S. с благодарностью отмечает поддержку и финансирование, предоставленные Юргеном Плицко и Вольфгангом Баумайстером. T.H. и P.S. получили финансирование через Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) – Project-ID 201269156 – SFB 1032 (A09). N.H. был поддержан грантом DFG на возврат HU 2462/3-1. P.S. признает поддержку через исследовательскую сеть MaxSynBio через совместную инициативу финансирования Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) и Общества Макса Планка.
annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
Refeyn One | Refeyn Ltd. | – | mass photometer |
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | – |