Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Seguindo o protocolo detalhado aqui para a preparação de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em câmaras de fluxo (Figura 1), pode-se reconhecer claramente um padrão semelhante a manchas na visão nativa de todas as condições exibidas (Figura 2). Este efeito é causado pela rugosidade superficial do vidro, que geralmente domina o sinal de dispersão e leva a condições visualmente indistinguíveis (vidro, vidro com SLB, ou vidro com SLB e proteínas anexadas). A presença de vesículas, no entanto, é claramente distinta devido à grande seção transversal de dispersão das vesículas e permite a observação da ruptura e fusão de vesículas em membranas homogêneas (Figura 2B e Filme Suplementar 1). Ao remover o sinal de dispersão estática da superfície do vidro com uma abordagem ratiométrica que enfatiza os elementos dinâmicos dentro do campo de visão24,25, pode-se descobrir proteínas sem rótulo difundindo na membrana (Figura 2D) enquanto um SLB vazio (Figura 2C) ou o próprio vidro (Figura 2A) aparece como uma imagem barica. O fundo inerente das medições de MSPT pode ser estimado localmente dividindo cada valor de pixel através da mediana de n precedentes e pixels sucessores do filme na mesma posição de imagem (Figura 3). Como resultado, macromoléculas aparecem como funções isotropicais de propagação de pontos (PSFs) cujo movimento na membrana pode ser observado, rastreado e quantificado. De fato, a disponibilidade tanto de contraste quanto de comportamento dinâmico permite a relação direta do tamanho molecular de uma partícula com seu respectivo comportamento difusivo, tudo sem a necessidade de rotular a partícula. No entanto, para interpretar o contraste iSCAT determinado durante os experimentos do MSPT, é essencial realizar uma calibração que traduz a amplitude do sinal em massa molecular. Isso pode ser conseguido anexando biomoléculas de massa conhecida a um SLB através de um complexo biotina-streptavidin-biotina (Figura 4A). Como estratégia exemplar, pode-se usar variantes biotinilatas de gróbios bovinos albumina (BSA), proteína A (prA), fosfatase alcalina (AP) e fibronectina (FN), que se ligam ao streptavidina (STP) que em si está ligado a lipídios contendo biotina (Biotinyl Cap PE) na membrana. Como mostrado na Figura 4A, o contraste cada vez mais pronunciado dessas macromoléculas exemplares reflete o aumento do peso molecular dos respectivos padrões biotinilados. Ao atribuir cada pico dos histogramas de contraste (Figura 4B) à massa correspondente do estado oligômero da proteína padrão, uma relação linear entre contraste e massa é revelada21,22 e pode ser posteriormente usada para a análise de sistemas macromolecule desconhecidos (Figura 4C). Um bom exemplo demonstrando a aplicabilidade e as capacidades do MSPT para analisar pesos moleculares e, portanto, estudar estados oligômeros e eventos de oligomerização é a consideração da aldolase biotinilada e do IgG biotinilado (Figura 5). Aldolase é comumente relatado como um homotetramer32. No entanto, a distribuição em massa resolvida pelo MSPT apresenta quatro picos distintos, o que destaca a presença de múltiplas populações (Figura 5A). Enquanto o primeiro pico menor corresponde a streptavidina desocupado e pode ser esperado devido à configuração neste tipo de experimento, complexos de aldolase com apenas duas subunidades (2SU) ou seis subunidades (6SU) também podem ser detectados (Figura 5B). Curiosamente, os complexos tetra e hexameric aldolase-streptavidin apresentam um coeficiente de difusão reduzido quando comparados apenas à adolase dimérica e streptavidin, indicando um aumento do arrasto viscoso, por exemplo, através da fixação de um segundo lipídio biotinilado ao streptavidin. Da mesma forma, o IgG biotinylated exibe três picos na distribuição em massa, com o primeiro pico novamente correspondendo à massa de um único streptavidin. A massa do pico mais abundante corresponde à massa de uma cadeia leve e uma pesada (1SU), ou seja, metade de um anticorpo IgG. O anticorpo completo com duas metades idênticas (2SU) é detectado em cerca de 11% dos casos. A diminuição do coeficiente de difusão com tamanhos complexos crescentes indica interações do streptavidina com mais de um lipídio biotinilado ou arrasto adicional causado pelo IgG anexado, ou ambos. Além da análise única dos estados oligômeros dependentes da membrana, o MSPT também confere a vantagem particular de correlacionar o comportamento difuso de uma macromolécula de interesse com seu estado oligômero. Os resultados representativos para este tipo de análise são mostrados para a subunidade de toxina de cólerina V (AnV) e cólera toxina B (CTxB), que se ligam à dioleoylphosphatidylserine (DOPS) ou glicosfingolipids (GM1), respectivamente, incorporadas na membrana (Figura 6A). Ambas as estimativas de densidade do kernel (KDEs) apresentam distribuições unimodais de massa e difusão, indicando uma única espécie abundante com comportamento difusivo semelhante. A posição máxima do coeficiente de massa molecular e difusão foi de 49,8 ± 2,2 kDa e 1,4 ± 0,1 μm2/s, respectivamente, para AV, bem como 62,7 ± 3,1 kDa e 0,4 ± 0,1 μm2/s, respectivamente, para CTxB. Os coeficientes de difusão medidos são comparáveis aos valores relatados anteriormente obtidos a partir de AFM de alta velocidade e FRAP33,34. A massa ligeiramente reduzida em comparação com a massa da macromolécula esperada (52 kDa para um aparador de AnV, 65 kDa para um pentamer CTxB) pode indicar a presença de complexos menores com menos subunidades no conjunto. Embora a diferença de massa entre as proteínas seja pequena e próxima do limite de detecção especificado do microscópio (≈50 kDa), seus coeficientes de difusão diferem consideravelmente. Em uma mistura equimolar, por exemplo, comparando a difusão da mistura apenas à distribuição de AnV e CTxB, pode-se concluir que o AnV é mais abundante na membrana do que o CTxB (Figura 6B). No entanto, se a concentração de CTxB for dobrada em comparação com a concentração de GNV, o equilíbrio é deslocado para CTxB como a proteína predominante na membrana. Como ilustrado para misturas de AnV e CTxB, o MSPT não só permite discriminar macromoléculas associadas à membrana de acordo com seu peso molecular, mas também permite a discriminação de diferentes populações macromoléculas de acordo com seu comportamento difusivo. Como em todas as técnicas de microscopia, alguns requisitos experimentais são cruciais para alcançar a qualidade desejada dos dados. Um exemplo importante neste contexto são as coberturas completamente limpas. Em geral, este é considerado um pré-requisito para experimentos de molécula única relacionadas à microscopia, mas o MSPT é particularmente sensível às impurezas amostrais. O aumento da dispersão originária da superfície de vidro de tampas impuras impede qualquer medição quantitativa do iSCAT. Notavelmente, mesmo partículas residuais de sujeira ou poeira em vidro insuficientemente limpo podem causar notáveis distorções de imagem, reconhecíveis como pontos brilhantes no modo de imagem nativo (Figura 7A). Embora esses defeitos sejam removidos pela estimativa de fundo devido à sua natureza estática, a determinação precisa do contraste de uma partícula pode ser prejudicada e, portanto, influencia negativamente sua análise quantitativa. Outro problema comum encontrado nos experimentos do MSPT são as vesículas remanescentes que flutuam (cercadas em laranja) pelo campo de visão ou vesículas não fundidas que estão presas (cercadas em azul) em uma posição específica na membrana e aparecem como grandes dispersores pulsantes (Figura 7B). Para minimizar sua ocorrência e interferência na aquisição de filmes, recomenda-se lavar bem o SLB antes de adicionar a proteína e usar misturas recém-preparadas de pequenas vesículas unilamellar (SUVs) e cáções divalentes. Um fator que deve ser levado em conta para o projeto de experimentos de rastreamento de partículas sensíveis à massa é a densidade de macromoléculas associadas à interface da membrana. Altas densidades de partículas na membrana podem de fato causar problemas por duas razões: i) A ligação de detecções de partículas de quadros consecutivos em trajetórias torna-se ambígua e, portanto, aumenta a probabilidade de erros e coeficientes de difusão mal julgados. ii) A massa de partículas, que é extraída da amplitude de seu ajuste PSF correspondente, torna-se sistematicamente subestimada e os picos de massa se ampliam porque a separação do sinal de fundo estático do sinal de partícula dinâmica é cada vez mais difícil (Figura 7C). Atualmente, a avaliação visual da qualidade dos dados no processo de aquisição de vídeos MSPT é difícil nos microscópios comerciais disponíveis porque a visão racionada implementada no software de aquisição está usando a remoção de fundo estabelecida para fotometria em massa21 em vez do algoritmo baseado em mediana descrito aqui e nas referências24,25 (Figura 7D ). A remoção contínua de fundo baseada em média usada para visualizar moléculas de pouso na fotometria em massa faz com que partículas de difusão apareçam como frentes escuras com caudas brilhantes, o que faz com que as manchas pareçam altamente anisotrópicos e interfere com o encaixe do PSF durante o procedimento de detecção. Assim, o uso do processamento de imagem baseado em média implementado no software de aquisição é inadequado para a análise de biomoléculas difusas em membranas. Figura 1: Diagrama de fluxo de processo das etapas individuais necessárias para analisar as interações proteína-membrana com rastreamento de partículas sensíveis à massa (MSPT). Para preparar amostras para as medições do MSPT, as lâminas de cobertura de vidro devem ser completamente limpas e ativadas com um plasma de oxigênio. Após sua montagem em câmaras de fluxo de amostra, pequenas vesículas unilamellar (SUVs) são preparadas para a formação de bicamadas lipídicas suportadas (SLB) e todos os buffers de reação são filtrados para reduzir a dispersão de fundo. Os SUVs são adicionados para formar bicamadas lipídicas nas câmaras de fluxo. Opcionalmente, cations divalent, como íons Ca2+ podem ser adicionados aos SUVs para promover a ruptura vesícula. Por fim, baixas concentrações da proteína de interesse são lavadas na câmara de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Visão nativa e racionmétrica de superfícies exemplares relevantes para as medições de TMPT. Imagens representativas da rugosidade superficial de um slide de tampa de vidro (A), durante a formação de uma bicamada lipídica suportada (B), com uma bicamada lipídica intacta (C) e de proteínas exemplares reconstituídas em um SLB (D). Todos os quatro exemplos são exibidos no modo nativo, que pode ser acessado durante a medição em si, e como imagens racionadas processadas após a remoção de fundo baseada na mediana. As barras de escala representam 1 μm. Para análise de dados (ver notebook Jupyter acompanhado; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Diagrama passo a passo das etapas necessárias para coleta e análise de dados do MSPT. Após a aquisição de dados para a amostra de interesse no fotômetro de massa, os filmes são processados para remover o fundo estático através de uma abordagem mediana deslizante em termos de pixels. Posteriormente, as partículas candidatas são identificadas e montadas por uma função de propagação de ponto (PSF) antes de sua ligação em trajetórias de partículas. Para permitir a determinação do coeficiente de difusão para cada partícula, é utilizada a análise de deslocamento quadrado médio (MSD) ou distribuição de distância de salto (JDD). Nesta fase, os valores de contraste podem ser transformados em massas moleculares de acordo com a relação contraste-massa determinada através da estratégia de calibração. Como etapa final, as trajetórias podem ser filtradas com base em seu comprimento ou densidade de partículas de membrana e visualizadas pela estimativa de densidade bidimensional do kernel (2D-KDE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Calibração da relação massa-contraste para medições de MSPT. (A) Quadros métricos de razão representativa obtidos para complexos proteicos padrão-proptavidin exemplares difundidos em uma bicamada lipídica suportada contendo uma pequena porcentagem de lipídios biotinilados (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE razão de 70:29.99:0.01). Como modelo de padrões de peso molecular, a monovalente streptavidin28 (somente STP) ou a estreptavidinadivalenta 28 em complexo com albumina de soro bovino biotinína (BSA), proteína biotinilada A (prA), fosfatase alcalina biotinilada (AP) ou fibronectina biotinilada (FN) são mostradas. As manchas de candidatos são destacadas em laranja (círculos tracejados) e detecções de partículas bem sucedidas são destacadas em vermelho (círculos sólidos). As barras de escala representam distribuições de densidade de probabilidade de 1 μm. (B) de valores de contraste obtidos para as cinco proteínas padrão modelo. Todos os dados apresentados representam distribuições agrupadas de três experimentos independentes por condição: STP apenas n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065, e FN n = 71.759 trajetórias. Em comparação com os números de partículas determinados para membranas com proteínas, o número de partículas detectadas em uma bicamada vazia é insignificante em densidades de membrana moderada (Figura Suplementar 1). Os picos de contraste considerados para a calibração de massa são marcados através de linhas contínuas, enquanto os tracejados representam estados oligômeros não considerados. (C) Curva de calibração contraste-a-massa derivada de contrastes de pico no painel D e nas respectivas massas sequenciais dos complexos. As barras de erro exibem o erro padrão dos locais de pico estimados pelo bootstrapping (100 resamples com 1.000 trajetórias cada). Para análise de dados (ver notebook Jupyter; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1.001 quadros, limiar de detecção (thresh) = 0,00055, alcance de pesquisa (dmax) = 4 pixels, memória (max_frames_to_vanish) = 0 quadros, comprimento mínimo da trajetória (minimum_trajectory_length) = 7 quadros (somente STP), 9 quadros (BSA/FN), 15 quadros (prA), 10 quadros (AP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Decifrando estados oligômeros de proteínas associadas à membrana. (A) Estimativas de densidade de kernel 2D de massa e coeficiente de difusão de estreptavidina tetravalente em complexo com aldolase biotiningada (painel esquerdo) ou com um anticorpo IgG de cabra modificado por biotina (painel direito). A reconstituição de ambos os complexos foi realizada em uma bicamada lipídica suportada contendo DOPC, DOPG e Biotinyl Cap PE em uma razão de 70:29.99:0.01 mol%, respectivamente. No total, foram incluídas 116.787 trajetórias de três réplicas independentes para o complexo streptavidin-aldolase (densidade de partículas de 0,1 μm-2) e 348.405 para o composto streptavidin-IgG (densidade de partículas de 0,1 μm-2). Apenas partículas com comprimento de pista de pelo menos cinco quadros foram incluídas. São apresentadas distribuições marginais de probabilidades tanto de massa molecular (superior) quanto de coeficiente de difusão (à direita). O x preto em ambos os painéis marcam as respectivas máximas locais do KDE. (B) Comparação de massas oligômeras determinadas para o complexo de estreptavidina tetravalente com aldolase modificada por biotina (painel esquerdo) ou IgG biotinilado (painel direito) com, de acordo com as massas sequenciais, pesos moleculares esperados. A abreviação SU é introduzida em nome da subunidade da proteína dos interesses. As barras de erro exibem o erro padrão dos locais de pico estimados pelo bootstrapping (100 resamples com 1.000 trajetórias cada). Para análise de dados (ver notebook Jupyter acompanhado; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1.001 quadros, limiar de detecção (thresh) = 0,00055, alcance de pesquisa (dmax) = 4 pixels, memória (max_frames_to_vanish) = 0 quadros, comprimento mínimo da trajetória (minimum_trajectory_length) = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Dissolvendo o comportamento difusivo das proteínas nativas que interagem membrana anexam V (AnV) e subunidade de toxina de cólera B (CTxB). (A) estimativas de densidade de kernel 2D tanto de massa quanto de coeficiente de difusão do anexo V (painel esquerdo) e subunidade de toxina de cólera B (painel direito). Para a reconstituição da membrana AnV e CTxB, foram utilizadas composições lipídicas de 80:20 mol% DOPC para DOPS e 99,99:0,01 mol% DOPC para GM1, respectivamente. No total, foram incluídas 206.819 trajetórias de três réplicas independentes para AV (densidade de partículas de 0,1 μm-2) e 142.895 trajetórias para CTxB (densidade de partículas de 0,2 μm-2). (B) Estimativas de densidade do kernel 2D das misturas CTxB e AnV em uma razão de 1:1 (painel esquerdo) ou 2:1 (painel direito), respectivamente. A reconstituição de misturas proteicas foi realizada em uma bicamada lipídica suportada contendo lipídios DOPC, DOPS e GM1 em uma razão de 80:19.99:0.01 mol%. No total foram incluídas 42.696 trajetórias de três réplicas independentes para a mistura 1:1 (densidade de partículas de 0,1 μm-2) e 264.561 trajetórias para a razão 2:1 (densidade de partículas de 0,3 μm-2). Para ambos (A) e (B), foram incluídas apenas partículas com comprimento de faixa de pelo menos cinco quadros. São apresentadas distribuições marginais de probabilidades tanto de massa molecular (superior) quanto de coeficiente de difusão (à direita). O x branco em cada painel marca o respectivo máximo global do KDE. Para análise de dados (ver notebook Jupyter acompanhado; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1.001 quadros, limiar de detecção (thresh) = 0,00055, alcance de pesquisa (dmax) = 4 pixels, memória (max_frames_to_vanish) = 0 quadros, comprimento mínimo da trajetória (minimum_trajectory_length) = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Complicações potenciais no curso das medições do MSPT ou durante a análise de dados. (A) Imagens representativas da rugosidade superficial exibidas tanto na visão nativa quanto na razão de fundo processada (remoção de fundo mediana) de um deslizamento de vidro de cobertura impura. Em ambos os casos, os pontos brilhantes constituem impurezas residuais da superfície que impedem as medições livres de artefatos. (B) Imagens exemplares de vesículas residuais no campo de visão após lavagem insuficiente da membrana. Tanto as vesículas estáticas (destacadas em azul) quanto a difusão (destacada em laranja) prejudicarão a qualidade da medição, seja devido ao pulsante e à agitação ou devido ao seu movimento direcional, respectivamente. (C) Como técnica de partícula única, o MSPT requer baixas densidades de partículas (imagem representativa, painel superior) para permitir a ligação adequada e a determinação em massa de cada partícula. No caso de altas densidades de partículas de membrana (painel médio), o encaixe de partículas é prejudicado, o que afeta a determinação em massa (ver painel inferior). (D) Imagens de proporção representativa de partículas difundindo em uma interface de membrana após a base média (painel superior) ou a remoção de fundo baseada em mediana. Para difundimento de partículas, a estratégia de remoção de fundo baseada em média produz imagens distorcidas do PSF da partícula, como pode ser visto nos pequenos insets entre o painel superior e médio. Em contraste, PSFs de partículas não retorcidos podem ser obtidos através da abordagem baseada em mediana. Painel inferior: Comparação dos perfis de linha através do centro do PSF obtido após a remoção de fundo média ou mediana. Para todas as imagens nativas e racionadas exibidas nesta figura, as barras de escala representam 1 μm. Para análise de dados (ver notebook Jupyter acompanhado; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1.001 quadros, limiar de detecção (thresh) = 0,00055, alcance de pesquisa (dmax) = 4 pixels, memória (max_frames_to_vanish) = 0 quadros, comprimento mínimo da trajetória (minimum_trajectory_length) = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1: Comparação de membranas livres de proteínas e ocupadas. Imagens representativas de uma bicamada lipídica intacta suportada antes (A) e depois (B) a adição de streptavidina purificado (STP). As vagas de candidatos que foram bem encaixadas no modelo PSF estão cercadas em vermelho. (C) Distribuições de probabilidade de contraste de partículas detectadas em uma membrana vazia (fundo de membrana, cinza) e em uma bicamadas com partículas estreptavidinas difusas (azul). Ambas as distribuições de probabilidade representam os dados agrupados de três experimentos independentes com parâmetros idênticos de aquisição e análise de filmes. Para análise de dados (ver notebook Jupyter acompanhado; etapa 9), foram utilizados os seguintes parâmetros: tamanho médio da janela (window_length) = 1.001 quadros, limiar de detecção (thresh) = 0,00055, alcance de pesquisa (dmax) = 4 pixels, memória (max_frames_to_vanish) = 0 quadros, comprimento mínimo da trajetória (minimum_trajectory_length) = 7 quadros. Clique aqui para baixar este Arquivo. Filme suplementar 1: Filme exemplar mostrando a ruptura e fusão de vesículas em uma membrana homogênea registrada com o fotômetro de massa. Tamanho médio da janela de processamento de imagem (window_length) = 1.001 quadros. Barra de escala: 1 μm. Faixa de contagem de câmeras: preto = 16.892; branco = 65.408. Clique aqui para baixar este Filme. Filme suplementar 2: Filmes exemplares que mostram a difusão dos complexos de anexo V (superior) e aldolase biotinína (inferior) em uma bicamada, obtidos a partir de medições do MSPT. Tamanho médio da janela de processamento de imagem (window_length) = 1.001 quadros. Barra de escala: 1 μm. Faixa de contraste de dispersão interferométrica: preto = -0,0075; branco = 0,0075. Clique aqui para baixar este Filme.